Detección, caracterización y análisis funcional de la complejidad clonal en la tuberculosis humana y bovina
Yurena Navarro García defendió su tesis doctoral en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid
17 de diciembre de 2015
Las herramientas de genotipado en tuberculosis fueron desarrolladas inicialmente para la realización de estudios epidemiológicos. Sin embargo han permitido asimismo desvelar la complejidad clonal existente en las infecciones causadas por Mycobacterium tuberculosis (MTB) y Mycobacterium bovis (M. bovis), poniendo así en cuestión la asunción de que cada episodio de tuberculosis (TB) estuviera causado por una única cepa. De este modo se comenzaron a describir situaciones de coinfección por más de una cepa (infección mixta) o bien de presencia simultánea de variantes clonales (infección policlonal), pudiendo estas, además, ofrecer una distribución heterogénea de las mismas en los diferentes tejidos infectados (infección compartimentalizada).
Sin embargo, son pocos los estudios existentes entorno a estos fenómenos, y los que se han realizado atienden a la mera descripción de casos anecdóticos o al estudio de estos eventos en poblaciones en donde la incidencia de TB es alta. Así, el primer objetivo de esta tesis se centró en dimensionar la complejidad clonal existente en las infecciones por MTB en una población no seleccionada, en un entorno de moderada incidencia, donde las expectativas de encontrar la citada complejidad eran escasas. Mediante la aplicación de IS6110-RFLP y MIRU-VNTR se detectaron infecciones complejas en 11 pacientes con TB pulmonar (1,6%) y en 10 pacientes con TB pulmonar y extrapulmonar (14,1%). De estos 21 casos, 9 correspondieron a infecciones mixtas y 12 a infecciones policlonales. Por último, en 9 casos (5 pacientes con infección mixta y 4 con infección policlonal) se documentó la compartimentalización de la infección.
Tras la descripción sistemática de los casos de TB con infecciones complejas, nos centramos en el estudio de una de sus modalidades, la infección policlonal. En concreto decidimos abordar la evaluación del posible significado funcional que pudiera conllevar la adquisición de las sutiles reorganizaciones genéticas identificadas entre variantes clonales, que surgen como resultado de eventos de microevolución.
Primeramente, mediante un estudio in silico, observamos las potenciales implicaciones derivadas de la modificación en el número de copias de la secuencia IS6110 y en el número de repeticiones MIRU-VNTR. El análisis detectó que algunas de estas variaciones se localizan intragénicamente, con una potencial repercusión sobre la estructura y función de las proteínas codificadas e incluso con un impacto funcional completo en los casos en los que la modificación truncaba el gen donde se localiza. Además, se identificaron modificaciones de repeticiones localizadas intergénicamentes en algunos loci MIRU-VNTRs, que podían implicar un efecto en la expresión de genes adyacentes.
Tras el análisis in silico se pasó a objetivar experimentalmente el efecto en expresión génica que pudiera resultar de la variabilidad detectada en el número de repeticiones de ciertos loci intergénicos. Mediante la aplicación de RT-PCR cuantitativa en cuatro parejas de variantes clonales, se demostró que, en tres de los cuatro loci analizados, variaciones en 1 ó 2 repeticiones conducen a una modificación sutil en la expresión de los genes contiguos.
Finalmente, la evaluación del significado funcional de la microevolución debía incluir la comprobación de su impacto en la capacidad infectiva de las variantes. Partiendo de la premisa de que variaciones sutiles de infectividad pudieran no ser detectadas aplicando el modelo estándar de infección, realizamos cuatro modalidades de infección in vitro (macrófagos diferenciados a partir de la línea celular humana THP-1, con o sin activación por IFN-γ; infecciones individuales de cada variante y coinfecciones competitivas) gracias a las cuales se pudo documentar el efecto en infectividad asociado a las sutiles reorganizaciones genéticas mostradas entre variantes clonales.
Una vez analizada la dimensión de la complejidad clonal, y desvelado el impacto funcional de la microevolución, parecía oportuno estudiar estos eventos de modo exhaustivo en el seno determinados pacientes seleccionados, representantes de diferentes circunstancias clínicas. Estos estudios nos permitieron valorar el modo en el que las infecciones complejas pueden repercutir en determinados aspectos diagnósticos y terapéuticos, así como obtener información de la dinámica de los fenómenos de microevolución que no es posible adquirir a partir de los estudios descriptivos poblacionales.
El primer estudio correspondió a una paciente con sospecha de TB-MDR en la que la existencia de una infección compleja no sospechada condujo a dificultades en su manejo diagnóstico y terapéutico. La integración de un análisis clonal exhaustivo con estrategias de epidemiología molecular así como con los datos clínicos/ epidemiológicos del caso y su contexto, permitió desvelar que la paciente presentaba realmente una infección mixta con una cepa sensible y otra MDR. La cepa sensible era de reciente adquisición, circulaba en el entorno de la paciente, y había coincidido con la reactivación de una cepa diferente, MDR, infrarrepresentada y con menor fitness que la cepa sensible, tres años después de la exposición a un caso índice infectado con esa misma cepa MDR.
El segundo caso correspondió a un paciente con dos episodios secuenciales de TB, como resultado de una reactivación, en el que se aíslan variantes clonales diferentes en cada episodio. Este caso fue utilizado como modelo de análisis integrado de todas las estrategias analíticas desarrolladas a lo largo de este trabajo. Así, las variantes clonales fueron estudiadas por RFLP y MIRU-VNTR, mostrando variaciones en ambos marcadores. El análisis por WGS reveló la presencia de variabilidad de SNPs. La integración de todos estos datos permitió trazar la dinámica de microevolución acontecida, demostrando que cada variante había evolucionado de manera independiente a partir de una cepa parental. Ensayos de expresión demostraron que la variabilidad adquirida conducía a diferencias de expresión entre las variantes. Por último la aplicación sistemática de diversos modelos permitió identificar, en concreto en el modelo de infección competitiva en ratones Balb/c, una mayor capacidad infectiva de la variante aislada en el segundo episodio. Adicionalmente, una nueva variante emergió por microevolución durante un ensayo de infección in vitro en macrófagos y demostró tener un mayor fitness que la cepa parental. Todos los datos acumulados del estudio integrado de este paciente permitieron, adicionalmente, identificar la cepa como con alta capacidad de adquirir variabilidad. Este hecho sugiere que los eventos de microevolución, además de poder estar modulados por circunstancias clínicas y epidemiológicas, dependen de factores exclusivamente bacterianos.
El tercer caso analizado nos condujo a reforzar la hipótesis de la existencia de factores bacterianos implicados en los eventos de microevolución, puesto que condujo a la identificación de una cepa de baja tendencia a adquirir variabilidad, que complementa a la cepa de alta tendencia descrita en el caso anterior. Este caso correspondió a un paciente infectado persistentemente, durante 8 años, por una cepa Beijing que había sido responsable de un brote de grandes dimensiones en el pasado. La infección prolongada fue resultado de una mala adherencia terapéutica, la cual condujo a un tratamiento intermitente. Sorprendentemente, a pesar de las enormes oportunidades que ofrecía este escenario para la generación de microevolución, no se identificó aparición de mutaciones de resistencia ni variaciones en ninguno de los marcadores genotípicos habituales. Asimismo, la secuenciación de genoma completo no identificó la generación de ningún SNP a lo largo de toda la infección.
Una vez abordado el estudio de la complejidad clonal existente en la tuberculosis humana, analizados estos eventos en diversos ejemplos clínicos, y detectado el impacto funcional de la microevolución en MTB, quisimos transferir estrategias de análisis equivalentes, así como los conocimientos obtenidos, al abordaje del estudio de la complejidad clonal en TB bovina. Debido, en parte, al retraso en la implantación de estrategias de genotipado de alta discriminación en la caracterización de los aislados de por Mycobacterium bovis (M. bovis), las lagunas de conocimiento en relación a estos aspectos eran muy extensas.
Los estudios en MTB han demostrado que la técnica de MIRU-VNTR es la que ofrece una óptima identificación de infecciones mixtas y policlonales, y por tanto estudios equivalentes en M. bovis deberían poder aplicarla. Por ello, nuestro primer objetivo fue adaptar y optimizar esta técnica a la caracterización de M. bovis, desarrollando un diseño de PCR multiplex con análisis de productos en electroforesis capilar y asignación automática de alelos. La selección de loci la realizamos a partir de un estudio de epidemiología molecular en TB bovina, realizado en nuestro país, que identificó un panel de 9 loci como el idóneo para ofrecer una elevada discriminación. La aplicación de nuestro ensayo a una muestra de aislados de M. bovis demostró su eficiencia y poder discriminativo.
Una vez puesta a punto la una metodología idónea para abordar adecuadamente el fenómeno de las infecciones complejas por M. bovis, decidimos realizar un primer análisis focalizándonos en la modalidad más extrema e infrecuente de complejidad clonal, la infección compartimentalizada. Tras la selección de todos los animales de una población con aislamiento de M. bovis en dos o más localizaciones anatómicas diferentes y la comparación entre los espoligotipos, se desveló que 6 (10,9%) de ellos estaban infectados por cepas diferentes. Mediante la aplicación adicional de MIRU-VNTR se confirmó que la compartimentalización era estricta, con una única cepa seleccionada en cada localización. El análisis adicional de animales infectados de esas mismas explotaciones permitió trazar la presencia de las cepas implicadas en la compartimentalización en animales independientes, indicando que el evento se inició con una sobreinfección.
Finalmente, la existencia de explotaciones infectadas crónicamente por M. bovis ofrecía la oportunidad de abordar un estudio cronológico longitudinal de la dinámica en la que ocurre la microevolución en M. bovis, aspecto que no es posible abordar fácilmente en la TB humana. Este estudio podría considerarse como un modelo de estudio de la variabilidad que se puede adquirir por microevolución. Con este fin se seleccionaron 8 explotaciones de ganado vacuno que habían estado infectadas durante más de un año por una misma cepa. Se abordó un esquema de análisis por MIRU-VNTR secuencial de los aislados obtenidos a lo largo de la infección que reveló la existencia de microevolución en la mitad de las explotaciones estudiadas. Esta microevolución involucraba a distintos linajes e implicaba a diversos loci MIRU-VNTR. Se observó cómo la aparición de variantes clonales es independiente del tiempo de infección y del número de animales infectados. Además, se pudo observar cómo la variante generada por microevolución reemplazó a la cepa inicial en 2 de 3 explotaciones, sugiriendo una mayor aptitud infectiva.
En resumen, esta tesis constituye un avance en cuanto al análisis de los fenómenos de complejidad clonal tanto en la tuberculosis humana como bovina; desarrolla metodología y estrategias analíticas para optimizar su detección y abordar su caracterización y profundiza en el conocimiento de su significado funcional. Todos estos aspectos confluyen en un nuevo estado de conocimiento que facilitará la progresión futura en este ámbito de estudio.
