Tesis Doctoral defendida por Alberto Hipólito Carrillo de Albornoz en el Centro VISAVET de la Universidad Complutense de Madrid

4 de abril de 2024

La resistencia a antimicrobianos es una de las principales amenazas para la salud global del siglo
XXI. El uso indiscriminado de antibióticos, entre otros factores, ha provocado un incremento exponencial de bacterias resistentes a antimicrobianos en las últimas décadas. Se estima que cada año mueren entre
1.5 y 5 millones de personas debido a infecciones causadas por bacterias multirresistentes. Estos datos ponen de manifiesto la necesidad de tomar medidas urgentes para combatir esta amenaza, empezando por entender las fuerzas que rigen el éxito de las bacterias multirresistentes.

La excepcional capacidad de las bacterias para evolucionar y adaptarse a compuestos antimicrobianos está principalmente promovida por la transferencia horizontal de genes. Gran cantidad de genes de resistencia se transfieren de unas bacterias a otras mediante elementos genéticos móviles y plataformas como los plásmidos, transposones, e integrones.

Los integrones son plataformas genéticas capaces de capturar y almacenar nuevos genes embebidos en pequeños elementos genéticos móviles llamados cassettes. Los integrones poseen una estructura conservada, compuesta por una plataforma estable; donde se encuentran codificados el gen de la integrasa, los promotores Pc y Pint, y el sitio attI de integración; y por una colección variable de cassettes. La colección de cassettes se expresa desde el promotor Pc siguiendo un gradiente de expresión que mantiene silenciados los cassettes más alejados del promotor. Ante una situación de estrés, la integrasa se expresa, permitiendo la captación cassettes exógenos, así como la escisión y reordenamiento de los cassettes. Este reordenamiento permite la expresión de cassettes distales recolocándolos en primera posición de la colección. Por ello, los integrones actúan como memorias bacterianas de muy bajo coste capaces de proporcionar adaptación bajo demanda a su hospedador.

Los integrones móviles desempeñan un papel crucial en el aumento y propagación de la resistencias a antimicrobianos, siendo capaces de capturar y expresar más de 170 genes de resistencia antimicrobiana frente a la mayoría de antibióticos de relevancia clínica. Los integrones son plataformas de gran éxito, frecuentemente presentes en aislados clínicos de bacterias Gram negativas multirresistentes. Por el contrario, la prevalencia de los cassetes de resistencia en integrones varía ampliamente, incluso entre genes que confieren la misma resistencia a antimicrobianos. Este fenómeno sugiere que existen otros rasgos específicos que gobiernan el éxito diferencial de los cassettes de resistencia distintos al fenotipo que confieren.

Esta tesis doctoral tiene como objetivo caracterizar las fuerzas que rigen el éxito evolutivo de los cassettes de resistencia en integrones, así como profundizar en el modelo actual de integrón y su regulación. Para ello, hemos cuantificado los niveles de resistencia conferidos por estos cassettes así como el coste asociado a su expresión. Adicionalmente, y debido a su presencia en esta plataforma, hemos caracterizado el posible efecto de un cassette en la expresión de la colección posterior, así como la movilidad de cada uno de ellos.

A pesar de la gran relevancia clínica de esta plataforma, el conocimiento acerca de los genes de resistencia que porta se encuentra disperso en la literatura, impidiendo un análisis comparativo de los

mismos. Para estudiar de manera comparable las fuerzas que rigen el éxito de estos cassettes hemos generado la colección pMBA, compuesta por 136 cassettes de resistencia clonados en un entorno genético que mimetiza el natural. Abarcando el 76% de los cassettes de resistencia descritos en integrones móviles, es la mayor colección de cassettes de resistencia en integrones en la actualidad.

La caracterización del perfil de resistencia de cada cassette ha permitido confirmar la ya conocida especificidad por familias de genes, a la vez que pone de manifiesto grandes diferencias en los niveles de resistencia conferidos por genes filogenéticamente muy cercanos. Asimismo, hemos detectado genes que no confieren resistencia alguna, lo cual pone en duda el papel de las familias de genes qac y smr como genes de resistencia a desinfectantes.

Por su parte, la cuantificación del coste asociado a cada cassette ha revelado que ciertas familias, como los genes de resistencia a beta-lactámicos, poseen un gran coste en E. coli. Por el contrario, genes como aacA7 han demostrado ser beneficiosos para el fitness bacteriano en ausencia de selección, tanto in vitro como in vivo, sugiriendo un posible rol metabólico secundario de los mismos. Adicionalmente, competiciones bacterianas realizadas tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, han demostrado que los cassettes de resistencia pueden modificar drásticamente su efecto en el fitness bacteriano dependiendo de las condiciones oxigénicas del entorno, como en el caso de ereA2. Este hecho tiene una gran relevancia a la hora de entender la ecología y su prevalencia de los cassettes en entornos clínicos y ambientales.

Además de caracterizar la resistencia que confieren los cassettes y el coste que implican para su hospedador, hemos caracterizado la influencia de un cassettes en la colección posterior y su capacidad de recombinación en la plataforma. Por un lado, observamos que la identidad de un cassette puede modular la expresión de la colección posterior de manera transcripcional, añadiendo un nuevo nivel de complejidad al modelo de integrón. Este hecho posee importantes implicaciones en posibles fenómenos de co-selección ocurridos en infecciones tratadas con varios antibióticos. Por otro lado, las frecuencias de recombinación obtenidas para cada cassettes son muy variables, existiendo diferencias de hasta un millón de veces entre las tasas de recombinación de aacA52 y fosN. Si bien no hemos podido relacionar parámetros in silico como ΔG y pfold de los sitios attC de los cassettes y su tasa de recombinación en nuestros experimentos, encontramos una correlación entre los cassettes de resistencia a aminoglucósidos y altas tasas de recombinación.

Adicionalmente, durante el transcurso de este estudio hemos podido demostrar que los genes de resistencia a aminoglucósidos presentes en integrones no están regulados por riboswitches, tema de controversia en el campo hasta ahora.

Si bien todavía estamos lejos de comprender en su totalidad el éxito diferencial de cada cassette de resistencia, esta tesis doctoral ofrece una visión general y cuantificada de las fuerzas que rigen el éxito evolutivo de los cassettes de resistencia en integrones.