Poster presentado en Jornadas Vigilancia Sanitaria 2023: presente y futuro para 2030

6 de julio de 2023

Tercero-Guerrero D., Dominguez M., Moreno I., Blanco JL., Alvarez-Perez S. y Garcia ME.

Clostridioides (Clostridium) difficile (CD) es un patógeno entérico zoonótico, que puede
transmitirse a través de alimentos contaminados y/o por su diseminación en el medio ambiente. En humanos, la infección por CD (ICD) está principalmente asociada al uso de antimicrobianos que alteran la microbiota intestinal. Su acción patógena se debe a la producción de toxina A, toxina B y toxina binaria. Se ha estudiado detalladamente la acción por separado de las toxinas A y B, sugiriéndose que la toxina B juega un papel predominante en la ICD. Por tanto, esta toxina es la diana preferente de las pruebas de diagnóstico laboratorial.
Con el objetivo de evaluar la relación entre la producción de toxina de los aislados de CD con respecto al ribotipo y el toxinotipo se está desarrollando un método ELISA para la cuantificación de toxina B en cepas de CD. Las cepas utilizadas en estudio provienen de la colección de cepas del Grupo de Investigación COVEMI y se seleccionaron en base a su toxinotipo, ribotipo y patrones de sensibilidad antibiótica.
Para la implementación del ELISA se produjeron anticuerpos (Ac) de captura y de detección de antígeno. Primero, se realizó el diseño de la proteína recombinante (B-Tcd). Seleccionamos el dominio CROPs de la toxina B (540 aminoácidos). Se utilizó el vector de expresión pET-28a(+) de Novagen (Gen de resistencia a Kanamicina. Promotor T7lac) y la cepa bacteriana Escherichia coli BL21(DE3) de Life Technologies. Esta B-Tcd se utilizará como estándar para la curva patrón en el ELISA- Sándwich y como antígeno de inoculación para la producción de anticuerpos monoclonales (AcM) de ratones y policlonales (AcP) de conejo.
Por otro lado, hemos procedido al desarrollo de anticuerpos monoclonales (AcM) frente a la toxina B de CD, para ello, a ratones BALB/c se les administró la B-Tcd. Los esplenocitos procedentes del ratón con una respuesta humoral mayor frente al antígeno, analizada por ELISA y Western blot, fueron fusionados con células de mieloma de ratón SP2. Los hibridomas productores de anticuerpos específicos resultantes de la fusión, han sido seleccionados mediante ELISA indirecto y Western blot frente a la proteína recombinante. En la actualidad, se está realizando la selección de clones que tengan reactividad frente a la toxina nativa y la toxina recombinante para utilizarlo como AcM.
Finalmente, hemos obtenido un anticuerpo policlonal (AcP) de conejo frente a la toxina B empleando como inmunógeno la toxina recombinante y el toxoide.
Cuando se finalice el proceso de obtención de AcM procederemos al desarrollo del
inmunoensayo

	Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense (UCM).
	Servicio de Inmunología. Centro Nacional de Microbiología (CNM). Instituto de Salud Carlos III (ISCIII).

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