PhD Thesis defense by Carmina Gallardo Frontaura at the Faculty of Veterinary Medicine of the Complutense University of Madrid

June 18^th, 2003

La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad infecciosa del cerdo doméstico causada por el virus de la peste porcina africana (VPPA). Debido a que en la actualidad no existe una vacuna eficaz contra la PPA, los programas de erradicación y control de la misma pasan por la puesta en marcha de estrictas medidas sanitarias, por un diagnóstico de laboratorio eficaz, así como por estudios de epidemiología molecular que nos permitan identificar el origen de posibles brotes de la enfermedad. El incremento de cepas de baja virulencia capaces de inducir anticuerpos específicos en sangre durante largos períodos de tiempo, incluso años, y la ausencia de anticuerpos vacunales, son las dos razones fundamentales por los que el diagnóstico de la PPA se basa en la detección de anticuerpos específicos del VPPA. La técnica recomendada es el ELISA, seguida de la confirmación mediante el IB. Estas técnicas de diagnóstico cuentan con diversos inconvenientes cómo son el uso de virus vivo en la producción del antígeno por lo que su manipulación está restringida a laboratorios que reúnan las adecuadas condiciones de bioseguridad. Con el objetivo de mejorar los test de diagnósticos serológicos de la PPA, durante esta Tesis se han desarrollado nuevos métodos de diagnóstico para la detección de Ac frente al VPPA basados en el uso de las proteínas recombinantes p32, p54 y pp62 del VPPA cómo antígeno. Los resultados obtenidos muestran que el uso de estas proteínas en el diagnóstico serológico de la PPA mejora la sensibilidad y especificidad del diagnóstico convencional. De las tres proteínas recombinantes utilizadas, los mejores resultados se obtienen con la poliproteína pp62 indicando por un lado las propiedades antigénicas de esta poliproteína, y por otro lado una mayor estabilidad de los epítopos conformacionales presentes en la poliproteína pp62. Estas características hacen que la poliproteína pp62 del VPPA sea una de las proteínas más interesantes para ser usadas en el diagnóstico serológico de la PPA. Los estudios de caracterización molecular de aislados virales permiten conocer mejor los aspectos epidemiológicos de la enfermedad que producen, los mecanismos de evolución viral y establecer relaciones de filogenia entre diferentes aislados. En el VPPA estos estudios se han vito dificultados por el tamaño del genoma del VPPA (170-190 kb) y por su baja variación a nivel nucleótidico al ser una molécula de AND lo que ha limitado la secuenciación exhaustiva del genoma completo. Un tipo de variabilidad genética en el VPPA da lugar a pequeñas variaciones en la longitud del genoma inferiores a 1kb, detectables mediante secuenciación y se deben a variaciones en el número y en la secuencia de las unidades repetidas en tándem (SRT). Por tanto, el otro objetivo planteado en esta Tesis consistió en el análisis y caracterización de SRT de 35 aislados del VPPA originarios de diferentes zonas de Europa, África y América, mediante PCR, análisis de restricción y secuenciación. Los resultados obtenidos sugieren que todos los aislados europeos y americanos están estrechamente relacionados entre sí y con los aislados del oeste de África sin que se hayan podido encontrar variaciones significativas en las regiones analizadas. Por el contrario, en los países procedentes de Africa del sur y oriental, se observa mayor variabilidad en el análisis de las secuencias, posiblemente debido que en estos países la enfermedad se ha mantenido de forma endémica gracias a un ciclo de transmisión entre las garrapatas, los facoqueros y los cerdos domésticos. Las principales variaciones encontradas se deben a la inserción o selección de las SRT