Tesis Doctoral defendida por Verena Blume Serrano en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid

16 de junio de 2010

Streptococcus suis (S. suis) es un patógeno de especial importancia para el sector ganadero porcino dada su elevada prevalencia en los países con este tipo de industria, su implicación en diversos procesos clínicos, así como su papel de patógeno secundario de otras enfermedades de gran trascendencia para la producción porcina. Además del impacto sanitario y económico que este microorganismo tiene en las explotaciones de cerdos, S. suis es un microorganismo zoonósico, responsable de diferentes cuadros clínicos en el hombre. Estos factores han determinado que, actualmente, las infecciones causadas por esta especie bacteriana sean consideradas enfermedades emergentes, tanto en Medicina Veterinaria como en Medicina Humana.

Pese a su importancia, existe poca información sobre la estructura de la población de S. suis y la potencialidad de determinados clones para producir patología en el ganado porcino. Para poder ampliar el conocimiento sobre estas cuestiones, en el presente trabajo se ha realizado una caracterización fenotípica (perfil bioquímico, serotipificación y estudio de la expresión de las proteínas relacionadas con la virulencia MRP, EF y SLY) y una caracterización genética (electroforesis en campo pulsado [PFGE] y análisis de la secuenciación de múltiples genes [MLST]) de cepas de S. suis aisladas de procesos clínicos y de portadores en el ganado porcino en España. A partir de los resultados de caracterización fenotípica, se ha estudiado la diversidad bioquímica de S. suis, se ha comparado la expresión de las proteínas entre los serotipos 2 y 9, y entre los aislados clínicos y tonsilares de un mismo serotipo. También se ha analizado la variabilidad de los genes que codifican para estas proteínas entre los distintos grupos de aislados. La caracterización genética ha permitido el estudio de la diversidad y relación genética de los aislados de S. suis estudiados, así como determinar la posible existencia de clones prevalentes responsables de la mayoría de casos clínicos. Además, el análisis MLST ha permitido la comparación de los aislados de este trabajo con los aislados de S. suis circulantes en Europa.

El estudio de caracterización se centró en los aislados de los serotipo 2 y 9 por ser los más prevalentes tanto en España como en Europa. Todos los aislados de S. suis se identificaron tanto bioquímicamente como mediante PCR, y se observó una elevada diversidad bioquímica entre los aislados de este microorganismo.

Los resultados de serotipificación permitieron verificar que el serotipo 2 sigue siendo uno de los serotipos más prevalentes, así como confirmar el aumento de la frecuencia de aislamiento del serotipo 9, respecto a los datos tradicionalmente observados para este serotipo en España. Se estudió la expresión de las proteínas asociadas a la virulencia MRP, EF y SLY en todos los aislados, y se observaron diferencias en la expresión según el serotipo. Las cepas del serotipo 2, expresaron mayoritariamente los fenotipos MRP+EF+SLY+ y MRP+EF+SLY-, mientras que entre los aislados del serotipo 9 fueron los fenotipos MRP-EF-SLY+ y MRP-EF-SLY-, los que se aislaron más frecuentemente. Dentro de un mismo serotipo, las cepas clínicas y tonsilares expresaron fenotipos similares. Para la detección de los genes sly y mrp se utilizaron iniciadores específicos previamente descritos, mientras que para la detección del gen epf, se desarrolló una técnica de PCR con el diseño de iniciadores específicos para este gen. Los genes sly y mrp se detectaron en la práctica totalidad de los aislados, expresaran o no sendas proteínas, mientras que no fue así para el gen epf. Si bien epf se detectó en todos los aislados que lo expresaron (EF+), apenas se detectó el gen en los aislados EF-. El estudio de la variabilidad genética en los genes de virulencia sly, epf y mrp se realizó mediante secuenciación directa del gen correspondiente, y los genes presentaron entre un 90% y un 100% de homología con las secuencias publicadas en GenBank. Se determinó una variante del gen mrp con una deleción de 90 pb.

Se caracterizaron mediante PFGE un total de 244 aislados de S. suis. Los resultados obtenidos confirmaron la elevada diversidad genética de la población de este patógeno y que ambos serotipos presentaban una diversidad genética similar. Los aislados se S. suis de ambos serotipos formaron grupos genéticos separados en el dendograma generado a partir de los perfiles de PFGE, con un 65% de similitud. Los aislados del serotipo 2 mostraron un menor grado de relación genética entre sí que los aislados del serotipo 9. A pesar de la elevada diversidad genética se observó la existencia de varios clones prevalentes de S. suis con una mayor distribución ambiental que otros clones, causantes de muchos de los procesos clínicos en la población porcina. Los aislados clínicos y tonsilares se distribuyeron a lo largo del dendograma y estarían muy relacionados genéticamente. Varios aislados de los pulsotipos más prevalentes de ambos serotipos se analizaron mediante MLST. Todos los aislados del serotipo 2 pertenecieron al clon ST1, excepto uno que se asignó al nuevo perfil alélico ST124. Los aislados del serotipo 9 se asignaron a dos nuevos perfiles alélicos identificados en este trabajo, ST123 y ST125. ST123 resultó de la descripción de un nuevo alelo gki62 entre los aislados de este serotipo, mientras que ST125 resultó de una nueva combinación de alelos no descrita hasta ahora. El análisis mediante eBURST determinó que los aislados del serotipo 2 estudiados formaban parte del complejo clonal ST1, complejo que se ha descrito como el más distribuido a nivel mundial, y además expresaban mayoritariamente MRP+EF+SLY+ resultado que coincide con lo descrito para este clon. Los aislados del serotipo 9 se asignaron al complejo ST61 y no al complejo ST87 prevalente en Europa central como cabría esperar dado que España importa ganado porcino de Europa. Por tanto, los aislados del serotipo 9, ST123 y ST125, serían genéticamente distintos de los aislados europeos. Los aislados del serotipo 9 procederían de la expansión de aislados del complejo ST61 descrito en España en 2002. Estas diferencias a nivel genético estarían de acuerdo con los resultados de la expresión de las proteínas asociadas a la virulencia ya que los aislados del serotipo 9 de nuestro estudio prácticamente no expresaron MRP* mientras que la mayoría de aislados europeos de este serotipo la expresan.