Tesis Doctoral defendida por Filipa Moutinho Trigo da Roza en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid

14 de febrero de 2025

Los integrones son plataformas genéticas capaces de captar, almacenar y reorganizar casetes de integrón (IC), los cuales codifican genes con funciones diversas, incluyendo resistencia a antibióticos, resistencia a fagos o funciones metabólicas. Sin embargo, y a pesar de su diseminación e importancia, la detección de ICs sigue siendo un desafío, y muchas de las funciones que codifican aún se desconocen.

En esta tesis hemos desarrollado una herramienta biotecnológica para identificar ICs independientemente de su secuencia, fenotipo o contexto genético. Hemos rediseñado un integrón de clase 1 para que actúe como una plataforma de captura, incorporando ccdB o sacB como marcadores contraseleccionables con un sitio de integración attI1 incorporado. Estos marcadores permiten la selección de recombinantes en condiciones específicas, asegurando la viabilidad solo si son interrumpidos por ICs, con una baja tasa de mutantes de escape de 10⁻⁶, proporcionando un amplio rango para la detección de casetes. Primero demostramos que ambos marcadores contraseleccionables informan de la captura de ICs en un ensayo clásico de recombinación. Después, desarrollamos tres aplicaciones distintas para esta herramienta: 1) una versión plasmídica para recolectar ICs de integrones cromosómicos grandes, generando bibliotecas de hasta 10⁵ colonias por ensayo, 2) una versión cromosómica generando una E. coli centinela para conjugación, permitiéndonos detectar ICs provenientes de plásmidos conjugativos en aislados clínicos, y 3) una versión cromosómica implementada en V. cholerae, una bacteria naturalmente competente y genéticamente modificada, que permite la captura eficiente de ICs directamente desde ADN exógeno, incluyendo muestras con integrones plasmídicos y cromosómicos.

Esta herramienta permite detectar el contenido de integrones en muestras diversas con alta especificidad. Su diseño independiente de la secuencia representa un avance innovador para comprender la ecología de los casetes de integrón.