Tesis Doctoral defendida por Cristina Martínez Ovejero en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid

29 de septiembre de 2017

La introducción de los antibióticos en la práctica clínica supuso una auténtica revolución en la medicina. Su utilización no sólo sirvió para convertir a una de las principales causas de muerte del siglo XX, las enfermedades infecciosas, en enfermedades curables, sino que propició el avance de la medicina y la cirugía. Por todo ello, los antibióticos han permitido el alcance de hitos médicos que han mejorado sustancialmente la calidad de vida de las personas, permitiendo el aumento de la esperanza de vida. No obstante, poco tiempo después de empezar
a utilizarse los antibióticos, se observó la aparición de bacterias capaces de sobrevivir al efecto antibacteriano de los mismos. En principio, la aparición de estas resistencias antimicrobianas fue una consecuencia natural asociada al uso de los antibióticos. Sin embargo, a raíz de su uso incorrecto e indiscriminado, tanto en medicina humana y veterinaria como en agricultura, este fenómeno natural se aceleró de tal forma, que la velocidad de aparición de las resistencias superó la velocidad de descubrimiento de nuevas moléculas antimicrobianas. Consecuentemente, la situación actual a nivel mundial es crítica, puesto que nos enfrentamos a patógenos que son capaces de resistir a la totalidad de antibióticos disponibles, lo cual amenaza con acercarnos a la era post-antibiótica.
Para poder frenar el avance de las resistencias es necesario conocer cómo éstas
evolucionan y se transmiten, con el fin de predecir la emergencia de nuevos mecanismos de resistencia y nuevos medios de propagación. Las resistencias no se circunscriben a un determinado nicho, sino que son capaces de seleccionarse, evolucionar y diseminarse entre distintos ambientes. Además, hay que tener en cuenta que los antibióticos que se usan en medicina humana son los mismos que se utilizan en medicina veterinaria y en agricultura; si bien es cierto que actualmente en animales de abasto y en agricultura su uso está más regulado y
sólo se pueden utilizar antibióticos que hayan sido autorizados. Es por tanto fundamental, para conocer la verdadera ecología de los mecanismos de resistencia, estudiarlos no sólo en el ámbito de la medicina humana, sino también en el animal y ambiental. Las tetraciclinas, los aminoglucósidos y las polimixinas son un claro ejemplo de familias de antibióticos que están siendo utilizadas en salud pública, sanidad animal e incluso en agricultura. Algunos miembros de estas familias, como la tigeciclina o la colistina, forman parte de los antibióticos de último recurso, denominados de esta manera para fomentar que su utilización
se restrinja al tratamiento de infecciones causadas por microorganismos multirresistentes. Por lo tanto, el estudio y caracterización de los mecanismos de resistencia a estos antibióticos, en el ámbito animal, ambiental y humano, es fundamental para desarrollar medidas de prevención del avance de las resistencias y preservar la funcionalidad de estos antibióticos de tremenda importancia para la salud humana. Las enterobacterias son una familia de bacterias cuyos miembros forman parte de la microbiota del ser humano y de los animales. Además, pueden comportarse como patógenos oportunistas y producir infecciones tanto en animales como en el ser humano. Son una de las principales causas de enfermedades nosocomiales. La aparición enterobacterias resistentes a
antibióticos de importancia clínica está incrementándose de tal manera que su asociación con beta-lactamasas de espectro ampliado o carbapenemasas las sitúa dentro de las bacterias más peligrosas.
Por todo ello, el objetivo de esta tesis doctoral es la identificación y caracterización de mecanismos de resistencia frente a antibióticos de importancia clínica, presentes en enterobacterias aisladas de animales de compañía, del medio ambiente y de pacientes hospitalizados.
La tigeciclina es el primer y único miembro de la nueva clase de tetraciclinas, las
glicilciclinas, cuyo uso está restringido al ámbito hospitalario en medicina humana como terapia de elección para el tratamiento de determinadas infecciones (piel, intraabdominales, neumonías) causadas por bacterias multirresistentes. El principal mecanismo de resistencia frente a la tigeciclina es la sobreexpresión de bombas de eflujo, que extruyen el antibiótico al exterior celular impidiendo que alcance su diana de actuación, el ribosoma bacteriano. Hasta ahora, la resistencia a tigeciclina siempre había sido descrita en aislados clínicos procedentes de
muestras humanas. Sin embargo, en esta tesis doctoral describimos los primeros aislados resistentes a tigeciclina obtenidos de cepas animales, concretamente dos Klebsiella pneumoniae aisladas de la orina de dos perros. Pese a ser aislados de animales de compañía, los Sequence Types a los que pertenecen las dos cepas indican que ambas cepas son clones de origen humano mundialmente distribuidos. El mecanismo involucrado en la resistencia a tigeciclina es una bomba de eflujo; no obstante, no es la principal bomba responsable de la resistencia a tigeciclina
en K. pneumoniae. La identificación de estos dos aislados de origen humano en animales pone de manifiesto la transmisión y adaptación de clones entre nichos. Al mismo tiempo, abre nuevas vías de diseminación para los mecanismos de resistencia a tigeciclina, lo cual favorecerá a incrementar la velocidad de propagación de los mismos.
Los aminoglucósidos son un grupo de antibióticos de gran importancia clínica.
Principalmente se utilizan en el tratamiento de infecciones producidas por bacterias Gram negativas, aunque también por Gram positivas. Existen varios mecanismos que confieren resistencia a aminoglucósidos, entre los cuales destacan las metiltransferasas del ARNr 16S, debido a que confieren un elevado nivel de resistencia a prácticamente todos los aminoglucósidos disponibles en la práctica clínica. Además, estas enzimas suelen ir acompañadas de otros genes que confieren resistencia a otros antibióticos como betalactámicos o carbapenemas. En esta tesis doctoral quisimos estudiar cómo evolucionaban las bacterias y los plásmidos que portaban estas metiltransferasas dentro de un hospital en la India, con el fin de poder desarrollar métodos de detección rápida que sirvieran para frenar su diseminación. Para ello, llevamos a cabo técnicas de secuenciación masiva con 54 aislados clínicos de K. pneumoniae, obtenidos de muestras humanas, y sus transformantes, portadores de los plásmidos asociados a metilasas. Nuestros resultados identificaron la presencia de dos clones
predominantes diseminados por todo el hospital, siendo uno de ellos más reciente por la escasa variabilidad observada tanto en el núcleo de la bacteria como el plásmido. El otro también mostraba escasa variabilidad en el núcleo bacteriano; sin embargo su plásmido presentaba mayor variabilidad por la adquisición de genes de resistencia. Todos los aislados tenían en su genoma el gen fosA de resistencia a fosfomicina pese a que eran susceptibles a este antibiótico,
excepto uno de ellos que si tenía fenotipo de resistencia. La fosfomicina, que es un antibiótico antiguo que ha sido utilizado en el tratamiento de infecciones durante años, se ha introducido recientemente en la práctica clínica en la India, con el fin de ser utilizada en el tratamiento de infecciones producidas por microorganismos multirresistentes, debido a los bajos niveles de resistencia que se han observado. Sin embargo, como resaltamos en esta tesis, las bacterias multirresistentes pueden tener genes de resistencia a fosfomicina silenciados, que mediante
mutaciones podrían revertir la susceptibilidad fácilmente y acabar con la funcionalidad de la fosfomicina.
El reciente descubrimiento del primer mecanismo de resistencia a colistina mediado por plásmidos, mcr-1, generó gran preocupación en la comunidad médica. Hasta entonces, la resistencia a colistina había sido mediada por mecanismos cromosómicos, de transmisión únicamente vertical, y por tanto, más lenta. Sin embargo, la diseminación de la resistencia a colistina mediada por plásmidos, podría incrementar la ineficacia de la colistina en el tratamiento de infecciones y, puesto que este antibiótico se utiliza como último recurso,
supondría la falta de opciones terapéuticas. Desde que se identificó mcr-1, este gen y sus variantes han sido identificados en multitud de cepas de origen humano, animal y en alimentos. No obstante, han sido muy escasos los aislados portadores del gen procedentes del medio ambiente, lo cual sugería que mcr-1 se encontraba circulando confinado al ecosistema animal y humano. En esta tesis doctoral, identificamos un amplio número de enterobacterias procedentes de aguas residuales sin tratar, obtenidas de distintas plantas depuradoras del área
de Barcelona. El análisis filogenético de las mismas reveló la existencia de dos clones de E. coli predominantes, presentes en ambas plantas depuradoras, demostrando que ambos clones se encuentran circulando entre la población de Barcelona. Asimismo, la presencia de mcr-1 en bacterias procedentes de estaciones de tratamiento de aguas depuradoras, implica la liberación directa de estos clones al medio ambiente. Sorprendentemente, uno de los aislados ortadores de mcr-1 no presentaba fenotipo de resistencia a colistina, pero si su transformante. De nuevo, observamos un fenómeno de silenciación de genes, lo cual dificulta su detección y favorece su diseminación.
Como conclusión, esta tesis ayuda a tener un mayor conocimiento sobre la evolución y vías de propagación de mecanismos de resistencia relevantes para la salud pública. Dicho conocimiento podrá ser utilizado para adoptar medidas de control que ayuden a frenar el avance de las resistencias antimicrobianas y a predecir la emergencia de nuevos mecanismos de resistencia y sus vías de diseminación