Tesis Doctoral defendida por Coral Polo Vaquero en el Centro VISAVET de la Universidad Complutense de Madrid

6 de septiembre de 2023

La ganadería bovina extensiva en España es un sector caracterizado por su orientación prioritaria a la producción de carne y cuyo objetivo principal desde un punto de vista productivo es maximizar la producción de terneros por vaca y año. Los sistemas de explotación extensivos pueden ser capaces de emplear los recursos naturales del entorno contribuyendo al mantenimiento de ecosistemas resilientes siempre que se emplee un manejo adecuado de los mismos. España fue el tercer país en producción de vacuno de carne en la Unión Europea (UE) en 2020, habiendo generado el 24% de la carne de ternera. No obstante, los índices de fertilidad anual media de este sector en España son menores en comparación al resto de la UE (69% vs. 80%, respectivamente, en el año 2020), lo que repercute negativamente en la eficiencia de la producción. La infertilidad de etiología infecciosa es especialmente relevante en ganado bovino criado en extensivo, donde el macho desempeña un papel importante ya que un único macho (o un grupo muy reducido) puede emplearse para la cubrición de varias hembras.

La presencia de patógenos causantes de infertilidad en machos y la transmisión venérea de patógenos asociados a infertilidad por los machos son dos elementos esenciales para entender el papel que tiene el toro en la infertilidad infecciosa a nivel de rebaño. El objetivo de la presente Tesis es la mejora en el conocimiento sobre el papel del toro como elemento clave en los problemas de infertilidad de origen infeccioso en rebaños bovinos en extensivo, mediante el estudio de los patógenos asociados a infertilidad en el macho, así como la evaluación y/o desarrollo de herramientas diagnósticas de última generación y tradicionales, con especial atención a aquellas más comúnmente empleadas, como son el cultivo y la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), para la detección de Campylobacter fetus y Tritrichomonas foetus. Estos son dos patógenos asociados a infertilidad en bovino de reconocida importancia, tanto en España como a nivel mundial, para los cuales no existen tratamientos eficaces y que suelen cursar con infecciones asintomáticas en los toros que pueden actuar como portadores pasando fácilmente desapercibidos y dificultando su control.

En este contexto, en la presente Tesis se llevó a cabo una revisión sistemática de la literatura científica mediante cadenas de búsqueda en PubMed, Scopus y Web of Science. Fueron seleccionados 38 artículos (de un total de 2.224) desde 1966 hasta 2022 en los cuales se relacionaba la presencia de 27 patógenos diferentes con problemas reproductivos en rebaños compuestos por machos o ambos sexos. Los patógenos más frecuentemente detectados fueron: Herpesvirus bovino (BoHV) (identificado por el 26,3% del total de trabajos seleccionados), C. fetus (23,7%), T. foetus (18,4%), y el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV), Ureaplasma spp., y Mycoplasma spp. (10,5%). Destacó la ausencia de algunos patógenos con capacidad reconocida para producir problemas reproductivos en bovino como Histophilus somni, Aspergillus spp. o Candida spp.

Con el fin de profundizar en el conocimiento sobre microorganismos relacionados con la infertilidad en toros, se realizó un estudio metagenómico en 1029 muestras de lavados prepuciales de machos criados en régimen extensivo en España (una muestra por toro, donde 944 procedían de animales procedentes de rebaños con bajas tasas de fertilidad y 85 de animales procedentes de rebaños reproductivamente sanos). El estudio se realizó mediante el análisis de la región hipervariable V3-V4 del gen que codifica la subunidad 16S del ARNr bacteriano. Se puso de manifiesto la ausencia de poblaciones bacterianas potencialmente asociadas a infertilidad: i) diversidad alfa de los índices Shannon (p-valor = 0,745) y Simpson (p-valor = 0,403), y ii) diversidad beta mediante el índice Bray-Curtis que no mostró diferenciación de grupos en base a diferencias en el éxito reproductivo. No obstante, el análisis individual de las unidades taxonómicas operativas (Operational Taxonomic Unit, OTU) mostró la presencia de un género, Mycoplasma spp. significativamente asociado a infertilidad (p-valor < 0,001). Así mismo, se identificó C. fetus en el 2,75% de las muestras, todas ellas procedentes de rebaños con bajos índices de fertilidad. Por el contrario, otros microorganismos, como Ureaplasma diversum, fueron detectados en un alto porcentaje de animales de ambos grupos muestrales, evidenciando la necesidad de profundizar en el conocimiento del verdadero papel de patógenos oportunistas así como sobre los factores que desencadenan su potencial capacidad patógena. Por último, este estudio subrayó el potencial que tienen nuevos abordajes metodológicos disponibles actualmente, como la metagenómica, en el estudio de la infertilidad bovina de carácter infeccioso para la detección de microorganismos que puedan estar pasando desapercibidos en controles rutinarios o cuyo papel en infertilidad sea desconocido.

Con respecto a la mejora de las técnicas diagnósticas de microorganismos de conocido efecto sobre la fertilidad bovina, esta tesis se centró en dos patógenos, C. fetus y T. foetus. Respecto al diagnóstico de C. fetus mediante la técnica PCR, se realizó un estudio comparativo de protocolos dirigidos sobre diez dianas moleculares: i) los genes 16S del ARNr, gyrB, cpn60, cstA, cdtB y nahE para la identificación de la especie C. fetus, y ii) los genes ISCfe1, sapB2, parA y virB11 para la diferenciación de las subespecies C. fetus subsp. venerealis (Cfv) y C. fetus subsp. fetus (Cff). Se propuso una nueva técnica de PCR en tiempo real basada en un protocolo de pirosecuenciación sobre el gen gyrB que mejoraba las ratios de detección de C. fetus en muestras prepuciales de toros (siendo capaz de detectar el 95,1% de las muestras positivas) en comparación con otros protocolos de PCR previamente publicados. La diferenciación de subespecies de C. fetus es importante para el diagnóstico de la campilobacteriosis genital bovina (CGB), enfermedad de declaración obligatoria causada por Cfv, sin embargo, los resultados del trabajo demostraron la dificultad para la discriminación de subespecies mediante las técnicas PCR evaluadas.

Respecto a T. foetus (causante de la tricomonosis, enfermedad de declaración obligatoria en España), se evidenció la escasez de dianas genéticas disponibles para su detección mediante PCR siendo la práctica totalidad de estos protocolos basados en la región que comprende el gen del 18S, 5.8S, y 28S del ARN ribosómico y los espaciadores internos de la transcripción 1 y 2 (ARNr-ITS). Esta región es altamente homóloga en el género Tritrichomonas, lo que podría dar lugar a reacciones cruzadas con otras especies. Así, se seleccionaron cinco protocolos publicados basados en esta diana para evaluar su rendimiento diagnóstico. La disponibilidad de dianas alternativas para la confirmación de casos positivos a T. foetus en muestras clínicas puede ser de gran interés. Sin embargo, tan solo se han descrito: i) el microsatélite TfRE para el que existe publicada una única PCR convencional (también evaluada en este estudio comparativo) y ii) el gen que codifica la beta-tubulina 1 que corresponde a un kit comercial que carece de información publicada. En esta situación, en la presente Tesis, se diseñó y evaluó una nueva técnica PCR basada en el gen EF1-alfa-Tf1. Este protocolo presentó una elevada concordancia (coeficiente kappa de Cohen = 0,967) con la técnica de PCR tomada como referencia [McMillen y Lew, 2016 (señalada por la WOAH como opción válida para la detección de T. foetus). Asimismo, esta nueva técnica fue capaz de detectar 5,75 copias del genoma de T. foetus sin mostrar amplificaciones inespecíficas.

Por último, se estableció un protocolo de cultivo (técnica de referencia para el diagnóstico de la CGB) para Cfv a partir de muestras clínicas de toros mediante un estudio comparativo de cinco medios de transporte (Lander, Stuart, Weibridge, Thoman y PBS), tres medios de enriquecimiento (Preston, Brucella y Bolton) y tres medios de aislamiento (Agar sangre, Preston y Skirrow) bajo distintas combinaciones de temperatura (21±2ºC y 4ºC) y tiempo (24h y 48h) para el transporte de las muestras, y diferentes estrategias de cultivo en placa [empleo de filtros (de 0,45µm y 0,65µm de diámetro de poro) y temperaturas de cultivo (37ºC y 42ºC)] con el objetivo de limitar el crecimiento de microorganismos que pudieran competir con Cfv para maximizar su recuperación. Los mejores resultados fueron obtenidos con el medio de transporte Lander (donde fue sustituido el 5-fluoracilo por anfotericina B) conservado hasta 24h a una temperatura constante de 21±2ºC, en combinación con el medio de enriquecimiento Preston (cultivado a 37ºC durante 48h) y posteriormente sembrado en los medios sólidos Preston o Skirrow incubados a 37ºC durante 4 días en microaerofilia.

En conclusión, los resultados de la presente memoria de Tesis doctoral demuestran la necesidad de realizar más estudios acerca de las causas de infertilidad bovina de carácter infeccioso centrados en el verdadero papel del macho, así como de la utilidad de nuevas técnicas moleculares como los análisis metagenómicos, para la detección, estudio, y en última instancia, control de microorganismos que puedan estar pasando desapercibidos mediante herramientas diagnósticas de uso rutinario. De igual modo, en referencia a las técnicas diagnósticas rutinarias más comúnmente empleadas para la detección de C. fetus y T. foetus (cultivo y PCR), se ha puesto de manifiesto las limitaciones de las opciones actuales y la susceptibilidad de mejora de dichas herramientas en términos de rendimiento diagnóstico, proponiendo nuevos protocolos para este fin.