Laura Carrilero Aguado defendió su tesis doctoral en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid

25 de enero de 2016

Los enterococos son cocos Gram positivos, catalasa-negativos y anaerobios facultativos que se presentan de manera individual, en parejas o en cadenas cortas. El género Enterococcus incluye la especie Enterococcus faecalis, uno de los patógenos nosocomiales más importantes actualmente. E. faecalis puede dar lugar a infecciones de heridas, tejidos blandos y tracto urinario. Puede provocar cuadros de bacteriemia lo que, en caso de un daño previo de las válvulas cardiacas, puede desembocar en un proceso de endocarditis. Se han identificado varios factores como importantes en la patogénesis de la bacteria, aunque aún no se ha esclarecido el modo en el que esta bacteria pasa del comensalismo a la patogenicidad. Además, esta bacteria suele ser portadora de determinantes de resistencia tanto intrínsecos como adquiridos. Un tratamiento con cefalosporinas, a las que el enterococo es intrínsecamente resistente, supone un factor de riesgo para la adquisición de una infección enterocócica.
La resistencia intrínseca a cefalosporinas es una de las más interesantes de las que presenta el enterococo. Se han identificado varios factores importantes para la misma, pero la relación entre ellos y sus efectores permanecen sin dilucidar.

El regulón SOS es una respuesta global de la bacteria ante un daño en su material genético. Se trata de una respuesta altamente coordinada para enfrentar las lesiones en el material genético mediante los procesos de recombinación, reparación del ADN, síntesis de translesión y la detención del ciclo celular para evitar la división celular si el material genético está dañado.
Los objetivos de este trabajo son caracterizar la respuesta SOS de E. faecalis, estudiar la implicación de la respuesta SOS en el perfil de resistencia a antibióticos y arrojar luz sobre el mecanismo de la reversión de la resistencia intrínseca dependiente de la respuesta SOS.

Los resultados del estudio de la respuesta SOS en los mutantes de inserción para los genes lexA y recA y para el mutante de lexA en el que no es posible inducir la respuesta SOS es compatible con una respuesta SOS clásica regulada por las proteínas LexA y RecA en esta bacteria. El mutante de inserción en el gen lexA, que tiene la respuesta SOS constitutivamente activada, es sensible a cefalosporinas. En presencia de mitomicina C en el medio, un agente alquilante que provoca roturas en el ADN y que por tanto induce la respuesta SOS, las especies E. faecalis, E. faecium y L. ivanovii son sensibles a cefalosporinas. Se estudió este fenómeno en dos cepas diferentes de E. faecalis, V583 y JH2-2, en las que se han construido mutantes de inserción para lexA. Estos mutantes tienen la respuesta SOS inducida constitutivamente y son sensibles a cefalosporinas.

In vivo la inducción de la sensibilidad a cefalosporinas en las bacterias silvestres se realizó administrando en ratones una combinación de ceftriaxona y levofloxacina, una fluoroquinolona que induce la respuesta SOS. En este modelo esta combinación disminuyo la carga bacteriana de manera significativa respecto a la cepa silvestre tratada solo con ceftriaxona.
Se realizó un estudio de la expresión génica de las cepas de E. faecalis V583 WT y su mutante V583lexA-, que presenta el sistema SOS constitutivamente inducido, para identificar el regulón SOS y estudiar el mecanismo mediante el que se revierte la resistencia a cefalosporinas. En el regulón SOS se han identificado genes que también forman parte del regulón SOS de otras bacterias, como son genes implicados en la recombinación y reparación del ADN. También presenta peculiaridades como la falta de un inhibidor de la división celular cuando la respuesta SOS está inducida y de una proteína de unión a hebra sencilla.

Ninguno de los determinantes genéticos descritos como importantes en la resistencia intrínseca a cefalosporinas presenta una gran variación en su expresión génica entre la cepa V583 WT y en la cepa V583lexA-. La diferencia de expresión de estos genes también se estudió mediante PCR cuantitativa. El patrón de expresión es diferente entre las cepas V583 y JH2-2, por lo que una diferencia de expresión de estos factores no parece implicada en el fenómeno. La reversión de la resistencia intrínseca a cefalosporinas observada en un mutante de V583 al que se le han delecionado los fagos descarta la implicación de los mismos en la reversión de la resistencia intrínseca a cefalosporinas.
Se realizó una librería de inserción por transposición a fin de identificar determinantes genéticos implicados en la reversión de la resistencia a cefalosporinas observada. Seleccionamos los mutantes que en presencia de mitomicina C permanecían resistentes a cefalosporinas.

Mediante esta técnica se identificaron dos transportadores de glutamina. Uno de ellos está regulado por el sistema de dos componentes CroRS, implicado en la resistencia intrínseca a cefalosporinas. El otro transportador de glutamina forma parte del regulón SOS que se describe en este trabajo.

También se identificaron un sistema transportador de cationes y un sistema transportador de péptidos. Éste último es homólogo a sistema Opp, implicado en el transporte de péptidos de la pared. En otro mutante por transposición la expresión de la proteína recO, cuyo producto es necesario para la inducción de la respuesta SOS, se encuentra presuntamente comprometida.

Finalmente en nuestra librería identificamos un mutante de inserción para el gen copY, el primer gen del operón Cop. Este operón está implicado en la homeostasis del cobre. Hay una caja Cop delante de un gen que codifica para una proteína de unión a hebra sencilla. Estas proteínas de unión a hebra sencilla participan en el proceso de inducción del sistema SOS.

Sorprendentemente, la presencia de CuSO4 en el medio produce en las cepas silvestres de E. faecalis y E. faecium el mismo prefil de antibiorresistencia que la presencia de mitomicina C. En un mutante de inserción en el segundo gen del operon, en el cual el represor copY es el único del operón que se expresa, la reversión de la resistencia a cefalosporinas ocurre en presencia de mitomicina C y no en presencia de CuSO4. Esto sugiere que, de las proteínas codificadas por el operón, es el regulador transcripcional CopY el que está implicado en la reversión intrínseca a cefalosporinas mediada por el sistema SOS.