Estudio comparativo de la respuesta inmune inducida por dos tipos de vacunas (VLP e inactivada) frente al virus de la Lengua Azul en ganado ovino
Tesis Doctoral defendida por Ana Cristina Pérez de Diego Camacho en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid
8 de junio de 2012
La Lengua azul (LA) es una enfermedad infecciosa, no contagiosa, transmitida por jejenes del genero Culicoides que afecta a diferentes especies de rumiantes, tanto domesticos, como silvestres. Los animales que desarrollan la enfermedad son fundamentalmente las ovejas, pudiendose alcanzar altas tasas de morbilidad y mortalidad. La enfermedad de la LA no afecta al ser humano, pero cobra gran importancia debido a su elevado poder de transmision y difusion provocando graves consecuencias socioeconomicas y sanitarias, que repercuten en el comercio internacional de animales y productos de origen animal. Por todo ello, la LA esta incluida dentro de la lista de enfermedades de declaracion obligatoria de la Organizacion Mundial de Sanidad Animal (OIE).
Esta enfermedad esta causada por un virus perteneciente al genero Orbivirus (familia Reoviridae), que presenta 7 proteinas estructurales (VP1-VP7) y cinco no estructurales (NS 1, 2, 3, 3A y 4). La VP2 destaca por su importancia en la respuesta inmune, ya que es la responsable de la formacion de anticuerpos neutralizantes, y especifica de cada serotipo.
En el contexto actual de Europa, donde se encuentran hasta 6 serotipos distintos (1,2,4,8,9,16), la vacunacion ha demostrado ser una herramienta basica para el control y la erradicacion de esta enfermedad como ha sido observado en Espana con la erradicacion de los serotipos 2 y 4.
La ausencia de inmunidad cruzada para diferentes serotipos supone un gran problema, puesto que implica inmunizar a toda la cabana para cada serotipo. Actualmente las vacunas de las que se dispone son monovalentes y solo en algunos casos bivalentes. Hasta la fecha tampoco se ha podido desarrollar un metodo de diagnostico que permita la diferenciacion entre animales vacunados con vacuna inactivada y animales infectados.
Con el fin de resolver los problemas anteriormente citados se han desarrollado las denominadas vacunas VLP (virus like particles). Se trata de complejos de proteinas estructurales (VP2, VP3, VP5, VP7), carentes de material genetico lo que conlleva incapacidad replicativa, que se ensamblan formando estructuras semejantes al virus autentico. Para su produccion se utilizan vectores de expresion basados en la utilizacion de Baculovirus. Este tipo de vacunas presentan grandes ventajas como su alto nivel de seguridad, la posibilidad de diferenciar animales vacunados de infectados, gracias a la ausencia de proteinas no estructurales como NS1, y la capacidad de generar vacunas polivalentes incluyendo en ellas diferentes VP2 pertenecientes a diferentes serotipos. Por todo ello presentan un gran potencial para convertirse en las vacunas del futuro, resultando necesario demostrar que este tipo de vacunas inducen una buena respuesta inmune y ofrecen una proteccion eficaz en los animales, teniendo en cuenta las condiciones actuales de Europa.
El objetivo de esta tesis es la valoracion de la respuesta humoral y celular producida por las vacunas VLP frente al virus de la LA y su comparacion con las inactivadas, valorando las ventajas e inconvenientes que presentan ambos tipos de vacunas en un escenario de control y erradicacion de la enfermedad. Para ello, se han adaptado tecnicas que permiten caracterizar el sistema inmune del ganado ovino, en condiciones fisiologicas normales, y la respuesta inmune que se produce como consecuencia de la aplicacion de las vacunas o tras la exposicion al virus.
Para caracterizar la respuesta inmune producida por las vacunas, se han estudiado diferentes parametros tales como: produccion de anticuerpos, niveles de viremia, o niveles de citoquinas inducidas. Para llevar a cabo este trabajo se han puesto a punto las tecnicas de deteccion mediante RT-PCR en tiempo real, de ARN mensajero que codifica para 6 citoquinas diferentes en el ganado ovino (IL2, IL4, IL10, IL12, IFNƒÁ y TNFƒ¿) asi como la deteccion de diferentes poblaciones celulares del sistema inmune en sangre periferica de ovino, a traves de la citometria de flujo (CD4+, CD8+, CD25+, CD14+, linfocitos B, la subpoblacion de linfocitos T ƒÁƒÂ TCR1-N6 y los WC1+).
A nivel experimental y dentro del proyecto europeo BTVAC FP6-2005-SSP-5A, se ha realizado un ensayo de dos vacunas VLPs, una monovalente frente al serotipo 1 y otra bivalente frente a los serotipos 1 y 4 del virus de la LA, asi como el ensayo de una vacuna inactivada monovalente frente al serotipo 1 en ovino. En este ensayo de vacunas, se ha realizado a diario el seguimiento y control de los animales con el registro de la sintomatologia clinica, la temperatura rectal y la temperatura superficial mediante termografia infrarroja. Tambien se realizaron extracciones de sangre periodicas para deteccion de virus por RT-PCR en tiempo real, presencia y niveles de anticuerpos por ELISA, deteccion de poblaciones celulares por citometria de flujo, y extraccion de ARNm para analizar la expresion de genes que codifican para citoquinas por PCR en tiempo real.
Los resultados de esta tesis indican que la respuesta inmune generada evita la aparicion de sintomatologia, lesiones y viremia tras la exposicion al virus homologo virulento, tanto con la utilizacion de las vacunas monovalentes (inactivada y VLP) como con la bivalente, lo que indica la seguridad de ambos tipos de vacunas para ser utilizadas incluso en presencia del vector. En la deteccion de sintomatologia clinica se ha analizado la posible utilizacion de la termografia infrarroja como herramienta de deteccion de fiebre, arrojando unos resultados con una sensibilidad y especificidad suficientes para su uso como herramienta de uso masivo, pudiendo esta herramienta ser utilizada en la vigilancia de animales centinelas.
La evolucion de la expresion de citoquinas ha mostrado la importancia de la IL2 en respuesta a la vacuna VLP monovalente y de la IL12 en respuesta a la vacunacion con VLP bivalente, asi como tras el desafio de los animales control con sus respectivos virus homologos virulentos. Por el contrario otras citoquinas como el IFNƒÁ, cuya importancia en la respuesta al virus LA habia sido previamente descrita, no ha podido demostrarse en algunos casos, debido a la variabilidad presentada tanto por la tecnica como por los animales. El analisis de las poblaciones celulares mostro en el caso de ambas vacunas VLP, el incremento de la poblacion CD25+ post-vacunacion, siendo mas evidente en el caso de los animales vacunados con vacuna VLP monovalente. Los animales vacunados con vacuna inactivada mostraron un aumento significativo en el porcentaje de linfocitos B. Tanto los animales vacunados con vacuna inactivada, como los no vacunados, mostraron un aumento en los linfocitos T CD8+ tras el desafio con el virus, no observandose variacion significativa en el caso de los vacunados con VLP.
La respuesta generada por ambos tipos de vacunas es suficiente para generar anticuerpos protectores tanto en el caso de las vacunas monovalentes para el serotipo 1 (VLP e inactivada) como en el caso de la vacuna VLP bivalente para los serotipos 1 y 4. Finalmente, los resultados obtenidos en los grupos control indican que el serotipo 1 presenta una mayor capacidad patogena que el serotipo 4.
