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Estudio de los factores que afectan al rendimiento diagnóstico de las técnicas de base celular y humoral de la tuberculosis caprina

Tesis Doctoral defendida por Javier Ortega Martín en el Centro VISAVET de la Universidad Complutense de Madrid

6 de junio de 2024

Javier Ortega Martín. Estudio de los factores que afectan al rendimiento diagnóstico de las técnicas de base celular y humoral de la tuberculosis caprina

La tuberculosis (TB) caprina es una micobacteriosis zoonósica causada por miembros del Complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB), principalmente por M. caprae y M. bovis. Debido a su impacto sanitario y económico esta enfermedad se encuentra sometida a programas de vigilancia y erradicación. En el caso de España, el Programa Nacional de Erradicación de Tuberculosis Bovina contempla la inclusión en el programa de aquellos animales de la especie caprina que presenten una relación epidemiológica con rebaños de ganado bovino. Además, se han instaurado programas de erradicación de TB caprina en algunas Comunidades Autónomas, recogidos también por un manual específico del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA) para armonizar criterios. Dichos programas están basados principalmente en una estrategia de diagnóstico y sacrificio posterior de los animales positivos a las pruebas diagnósticas, además de un sistema de vigilancia en matadero. El diagnóstico ante-mortem oficial de la TB caprina se realiza mediante las técnicas de intradermotuberculinización simple (IDTBs) y comparada (IDTBc), empleándose ocasionalmente el ensayo de liberación de interferón-gamma (IGRA, por sus siglas en inglés interferon-gamma release assay), siendo todas ellas técnicas basadas en la respuesta inmune de base celular. También existen técnicas de base humoral, de carácter no oficial, capaces de detectar anticuerpos específicos frente a los miembros del CMTB que han experimentado un gran desarrollo en la última década. El rendimiento diagnóstico de las técnicas basadas en la respuesta inmune de base celular, como de aquellas basadas en la detección de anticuerpos, puede verse afectado por diferentes factores. La presente tesis doctoral se compone de diferentes estudios, estructurados en dos capítulos, relacionados con las pruebas de diagnóstico inmunológico de la TB caprina, con especial atención a los factores que pueden alterar su rendimiento, todo ello con el objetivo de mejorar el control y erradicación de la enfermedad.

El primer capítulo de la presente tesis consta de tres estudios dirigidos a la optimización de las técnicas diagnósticas de base celular de la TB caprina, especialmente la IDTB, piedra angular de los programas de erradicación en esta especie. El primer estudio de este capítulo tuvo por objetivo evaluar el efecto del punto de inoculación, en una posición cervical o escapular, de las PPDs (por sus siglas en inglés, Protein Purified Derivative) sobre el rendimiento diagnóstico de la IDTB en ganado caprino. Para ello, se administraron las PPDs bovina y aviar en dichas partes anatómicas de animales pertenecientes a rebaños condiferente situación epidemiológica: alta prevalencia TB (n=96), baja prevalencia (n=94) y libre de TB (n=119). Además, se tomaron muestras de sangre para obtener plasma y suero para la realización del IGRA y de un ELISA (por sus siglas en inglés, enzyme-linked immunosorbent assay) denominado ELISA P22, respectivamente, para un mejor conocimiento del estatus sanitario de los animales. Se observó un número de reactores a la interpretación estándar de la IDTBc significativamente mayor (p < 0,01) en una posición cervical con respecto a la escapular, así como una presencia de signos clínicos en la localización cervical en el rebaño de alta prevalencia significativamente más alto (p < 0,01). En cambio, en el rebaño de baja prevalencia el número de reactores a la interpretación severa de la IDTBs fue significativamente superior (p < 0,01) en la posición escapular en comparación a la cervical. En el rebaño libre de TB se observó un número significativamente mayor (p = 0,016) de reactores a la interpretación severa de la IDTBs al administrar las PPDs en una posición cervical en comparación con la escapular. Los resultados de este estudio contribuyeron a que ambas localizaciones estén recomendadas por el Laboratorio de Referencia Europeo de Tuberculosis Bovina para la realización de la IDTB en caprino previa al movimiento intracomunitario, permitiendo así, el empleo de una posición cervical o escapular para la administración de las PPDs en esta especie al no verse afectado el rendimiento de la IDTB.

En el segundo estudio, de este primer capítulo, se evaluó el efecto de una pre-sensibilización producida por una IDTB anterior sobre los resultados de las técnicas de diagnóstico de la TB caprina. Para ello, los animales (n=48) de un rebaño caprino de alta prevalencia de TB fueron sometidos a dos IDTB sucesivas con un intervalo de separación de 3 días entre ellas. También se tomaron muestras de sangre para la obtención de plasma (IGRA) y suero (ELISA P22) los días 0 y 3 para evaluar el efecto de la pre-sensibilización previa sobre estas técnicas diagnósticas. En este estudio se observó un número significativamente mayor (p = 0,015) de reactores a la IDTBs en el grupo pre-sensibilizado en comparación al grupo control. Sin embargo, la pre-sensibilización mediante la administración de las PPDs bovina y aviar no produjo ningún efecto significativo en los resultados de las técnicas de diagnóstico in vitro (IGRA y ELISA P22). De esta forma, los resultados de este estudio determinaron el efecto de una pre-sensibilización reciente (3 días) con PPDs sobre los resultados de las técnicas de diagnóstico de la TB caprina produciendo un incremento significativo del número de reactores a la IDTBs.

Además, en el segundo y tercer estudio de este primer capítulo se determinó el efecto de la aplicación tópica (en el punto de inoculación de las PPDs) y parenteral (intramuscular en las tablas del cuello) de corticoides (betametasona y dexametasona) y de un antiinflamatorio no esteroideo (ketoprofeno) 48 horas tras la administración de las PPDs sobre los resultados sobre de las técnicas diagnósticas de TB. También se evaluó la posible detección de estas sustancias mediante la técnica de HPLC-MS (por sus siglas en inglés High-performance liquid chromatography-Mass spectrometry) en muestras de pelo (betametasona, dexametasona y ketoprofeno) y suero (dexametasona y ketoprofeno) obtenidas 24 horas tras la administración de los fármacos. Para ello, los animales de ambos estudios se sometieron a las técnicas de IDTBs e IDTBc y se tomaron muestras de sangre para la realización del IGRA (en plasma) y ELISA P22 (en suero) el día 0 y 3 del estudio. Las muestras de suero y pelo para la detección de las sustancias administradas se tomaron 24 horas tras la aplicación (tópica o parenteral) de los fármacos. En este muestreo también se obtuvieron muestras de suero para determinar el efecto de la administración intramuscular de dexametasona y ketoprofeno sobre los niveles séricos de 15 citoquinas y quimioquinas. En ambos estudios la administración de las sustancias de naturaleza antiinflamatoria derivó en un descenso significativo (p < 0,05) del número de reactores a la IDTBs. En cambio, no se produjo un descenso significativo de la reactividad mostrada por el resto de técnicas empleadas en el estudio (IDTBc, IGRA y ELISA P22). La detección de dichas sustancias por medio de HPLC-MS vino determinada por la vía de administración de la muestra, siendo óptima la detección de betametasona tópica en muestras de pelo, pero con escaso éxito la de dexametasona y ketoprofeno administrados intramuscularmente en muestras de suero y pelo. Los resultaron de este estudio demostraron que los niveles de las diferentes citoquinas y quimioquinas analizadas no se ven afectados por la administración de dexametasona y ketoprofeno ya que no se observaron diferencias significativas entre los grupos tratados y el grupo control en las muestras de suero obtenidas 24 horas tras la administración de los fármacos. Los resultados de ambos estudios han contribuido a un mayor conocimiento del efecto de la administración de sustancias antiinflamatorias en las pruebas de diagnóstico de TB, así como a poner de manifiesto la necesidad de desarrollar métodos eficaces para la detección de tales actividades.

El segundo capítulo de la presente tesis doctoral consta de dos estudios relativos a la optimización y mejora del rendimiento diagnóstico de la TB caprina mediante el empleo de técnicas basadas en la detección de anticuerpos, ampliando así el conocimiento sobre los diferentes factores que pueden influir en las mismas. El primer estudio del segundo capítulo consistió en la evaluación del efecto de tres factores sobre los resultados del ELISA P22 en muestras de leche caprina. La primera parte del estudio consistió en determinar el posible efecto de la fase de lactación en los resultados del ELISA P22. Para ello, se analizaron de forma mensual muestras de leche, procedentes de 44 animales de un rebaño caprino de alta prevalencia de TB, durante el periodo de lactación de 6 meses. La segunda parte del estudio se centró en la evaluación del posible efecto de una estimulación antigénica desencadenada por una IDTB previa reciente (efecto booster) sobre los resultados del ELISA P22 empleando muestras de leche y de suero. Con este objetivo se analizaron, mediante ELISA P22, muestras de suero y leche de 37 animales tomadas el día de la realización de la IDTB y los 15, 30 y 60 días posteriores. Finalmente, la tercera parte del estudio evaluó el efecto de sucesivos ciclos de congelación-descongelación en muestras de leches conservadas con azidiol sobre los resultados del ELISA P22. Se analizaron muestras de leche de animales previamente positivos y negativos al ELISA P22, siendo posteriormente conservadas con azidiol y sometidas a sucesivos ciclos de congelación y descongelación. Se observó un descenso del número de reactores al ELISA P22 al analizar muestras de leche obtenidas en los últimos dos meses de lactación con respecto a aquellas tomadas en muestreos previos. Respecto al efecto booster, los resultados del ELISA P22 evolucionaron de manera similar en muestras de suero y leche obtenidas a los 15, 30 y 60 días tras someter a los animales a una IDTB. De esta forma, los resultados cuantitativos del ELISA P22 más altos se obtuvieron a los 15 días en ambos tipos de muestra, maximizando la detección de animales infectados. Finalmente, el hecho de someter a las muestras de leche conservadas con azidiol a sucesivos ciclos de congelación-descongelación no se tradujo en diferencias significativas (p = 0,99) en los resultados del ELISA P22 en los diferentes análisis realizados entre cada ciclo. De esta forma, los resultados de este estudio determinaron el efecto de diferentes factores sobre los resultados del ELISA P22 empleando muestras de leche, siendo de un gran valor para mejorar el diagnóstico de base humoral de la TB caprina empleando este tipo de muestra.

En el último estudio de este segundo capítulo se evaluó la utilidad de las muestras de saliva empleando el ELISA P22. Con este objetivo, se analizaron con el ELISA P22 muestras de saliva y suero de animales procedentes de una explotación caprina históricamente libre de TB (n=113) y de una segunda explotación de alta prevalencia de TB (n=197) atendiendo, en ambos casos, a los resultados obtenidos en saneamientos previos mediante IDTBs e IDTBc. Los resultados obtenidos en la explotación libre de TB se utilizaron para calcular la especificidad del ELISA P22. Por otro lado, dado el alto número de reactores presente en el rebaño de alta prevalencia, se procedió a realizar un vacío sanitario en esta explotación. Así, aquellos animales que en la inspección post-mortem presentaron lesiones compatibles con TB y aislamiento bacteriológico (n=64) se incluyeron en el estudio para calcular la sensibilidad del ELISA P22 en muestras de saliva. Se observó una excelente especificidad [100% (IC 95%, 97,4–100)] del ELISA P22 en muestras de saliva, acompañada de una sensibilidad limitada [34,4% (IC 95%, 22,4–45,6)], la cual se incrementó al tener en cuenta a los animales con mayor grado de lesiones [75% (IC 95%, 53,7–96,2)]. En esta línea, se observaron lesiones pulmonares compatibles con TB significativamente (p = 0,018) mayores en los animales positivos al ELISA P22 en muestras de saliva en comparación a los negativos. Sin embargo, la sensibilidad del ELISA P22 en muestras de suero fue considerablemente superior, siendo del 87,5% (IC 95%, 77,2–93,5) en los animales a los animales con lesiones compatibles con TB y del 100% (IC 95%, 80,6–100) en los animales con lesiones más severas. De acuerdo a estos resultados, la sensibilidad del ELISA P22 para el diagnóstico humoral de la TB caprina empleando muestras de saliva mejora significativamente cuando se analizan animales que se encuentren en estadios avanzados de la enfermedad.



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TÍTULO: Estudio de los factores que afectan al rendimiento diagnóstico de las técnicas de base celular y humoral de la tuberculosis caprina


TIPO: Tesis doctoral


AUTOR: Javier Ortega Martín


DIRECTORES: de Juan L. y Bezos J.


FECHA: 6 de junio de 2024


IDIOMA: Spanish



CITA ESTA PUBLICACIÓN:

Javier Ortega Martín. Estudio de los factores que afectan al rendimiento diagnóstico de las técnicas de base celular y humoral de la tuberculosis caprina. Universidad Complutense de Madrid. 6 de junio de 2024. (Tesis doctoral)


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