Tesis Doctoral defendida por Carlos Serna Bernaldo en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid

14 de mayo de 2025

Los aminoglucósidos son antibióticos de amplio espectro fundamentales en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias Gram-negativas, tanto en medicina humana como veterinaria. Sin embargo, en las últimas décadas, su eficacia se ha visto amenazada por el aumento de la resistencia a los antibióticos, principalmente debido a la acción de las metiltransferasas del ARNr 16S (16S-RMTasas). Estas enzimas, identificadas a principios de los 2000, confieren altos niveles de resistencia a múltiples aminoglucósidos al modificar su diana en el ribosoma. La emergencia de estos genes es preocupante por su frecuente asociación con elementos genéticos móviles, lo que facilita su transferencia entre diferentes especies bacterianas. Esto acelera su diseminación en entornos clínicos, tanto humanos como veterinarios, especialmente cuando estos elementos también contienen genes de resistencia a antibióticos de último recurso, como las carbapenemasas.

En este contexto, es esencial comprender mejor los mecanismos de diseminación de estos genes de resistencia. Por ello, el objetivo principal de esta tesis es investigar cómo los elementos genéticos móviles, como plásmidos, transposones y elementos integrativos y conjugativos (ICEs), contribuyen a la propagación de las 16S-RMTasas. Para ello, hemos realizado cuatro estudios basados en el análisis genómico y epidemiológico de estas enzimas, utilizando principalmente grandes conjuntos de datos genómicos bacterianos disponibles públicamente.

En el primer estudio de esta tesis, realizamos un análisis general de la distribución y diversidad de las 16S-RMTasas en genomas bacterianos disponibles públicamente. Para ello, utilizamos la colección de genomas Blackwell, compuesta por 661.405 genomas provenientes de la base de datos European Nucleotide Archive (ENA) hasta 2018. Tras el cribado de estos genomas, identificamos 3.214 (0,48 %) que contenían al menos un gen de 16S-RMTasas. Clasificamos estas enzimas en tres grupos según su frecuencia de aparición: alta (armA, rmtB1, rmtC), moderada (rmtF1, rmtI2, rmtE1) y esporádica. Las enzimas más frecuentes presentaron una distribución global con importantes variaciones regionales; por ejemplo, rmtB1 se concentraba en Asia Oriental, particularmente en China, mientras que rmtC era más común en Europa. Además, observamos que estas 16S-RMTasas se encontraban mayoritariamente en bacterias de la familia Enterobacteriaceae, pero también en otros géneros bacterianos y, de manera destacable, en bacterias Gram-positivas como Clostridioides difficile.

En el segundo estudio, llevamos a cabo un análisis in silico sobre la diseminación global de las 16S-RMTasas mediada por plásmidos en Klebsiella pneumoniae. Para ello, compilamos un conjunto de 3.838 genomas de K. pneumoniae portadores de 16S-RMTasas, obtenidos de bases de datos públicas tras un proceso de dereplicación y control de calidad. Identificamos que rmtB1 y armA eran las 16S-RMTasas más frecuentes en esta especie bacteriana, distribuidas en varios secuenciotipos (ST), siendo el más común el ST11. Nuestros análisis sugieren que la diseminación de estos genes está impulsada principalmente por plásmidos que pueden transferirse horizontalmente, más que por expansiones clonales. Específicamente, el gen armA se asociaba principalmente con los plásmidos pNDM-Mar, IncM2 e IncC, mientras que rmtB1 se encontraba sobre todo en plásmidos IncFII(pHN7A8)/IncR e IncFII. Observamos que los plásmidos IncFII(pHN7A8)/IncR, que portaban rmtB1, estaban predominantemente relacionados con el ST11 en Asia Oriental, lo que indicaba expansiones clonales exitosas en esta región. Además, detectamos que la secuencia de inserción IS26 flanqueaba frecuentemente a armA y rmtB1, lo que sugiere su papel en la movilización de estos genes.

En el tercer estudio, investigamos la diseminación multiespecie de plásmidos IncR portadores del gen armA en poblaciones bacterianas clínicas y ambientales de un hospital veterinario en España. A través de la secuenciación del genoma completo de aislados obtenidos entre 2011 y 2020, identificamos cuatro cepas de Enterobacter hormaechei subsp. xiangfangensis ST171 en muestras clínicas equinas, todas portadoras del gen armA en un plásmido IncR. Estos plásmidos mostraron una gran similitud con plásmidos de un brote anterior de K. pneumoniae ST11 en el mismo hospital, sugiriendo una posible transferencia horizontal del plásmido. Realizamos un muestreo ambiental en el año 2022 que reveló la presencia de estos plásmidos IncR en varias especies bacterianas, incluidas E. hormaechei, K. pneumoniae, Citrobacter freundii y Mixta calida, lo que indicaba una diseminación multiespecie y policlonal en el entorno hospitalario. El análisis filogenético confirmó que los aislados ambientales no estaban relacionados con los clínicos, respaldando la hipótesis de una propagación horizontal de los plásmidos en lugar de una expansión clonal. Además, los experimentos de conjugación demostraron que, aunque los plásmidos IncR carecen de maquinaria conjugativa completa, pueden ser movilizados mediante los sistemas de conjugación de plásmidos cohabitantes.

En el cuarto estudio, investigamos la diseminación global de la pan-resistencia a aminoglucósidos mediada por una 16S-RMTasa considerada esporádica, npmA. Analizamos más de 1,9 millones de genomas bacterianos e identificamos 71 genomas que portaban el gen npmA, mayoritariamente C. difficile (n = 69) y dos aislados clonales de Enterococcus faecium. La mayoría de estos aislados presentaban la variante npmA2 y provenían de humanos, cerdos y del medio ambiente de seis países diferentes. El análisis filogenético mostró que npmA2 estaba principalmente asociado con el ST11 de C. difficile, un linaje ampliamente distribuido en poblaciones humanas y animales. Identificamos que npmA2 estaba integrado en un nuevo transposón compuesto, denominado Tn7734, flanqueado por copias de una nueva IS30, que denominamos ISCld1. Este transposón se localizaba dentro de un ICE de aproximadamente 33 kilobases (kb), designado ICE Tn7740, conservado en múltiples aislados y linajes de C. difficile. Además, los dos aislados de E. faecium que portaban npmA2 también contenían los mismos elementos (Tn7734 e ICE Tn7740), lo que sugiere una transferencia horizontal entre especies bacterianas.

En resumen, esta tesis ha demostrado que, aunque las 16S-RMTasas son poco frecuentes a nivel global, su capacidad para diseminarse entre diversas especies bacterianas y entornos supone una amenaza significativa. Plásmidos como IncR e IncF, junto con otros elementos genéticos móviles como IS26, Tn7734 e ICE Tn7740, juegan un papel clave en la movilización y persistencia de estos genes de resistencia a aminoglucósidos. La identificación de nuevos hospedadores, incluyendo bacterias Gram-positivas como C. difficile y E. faecium, amplía la comprensión de la epidemiología de estos determinantes de resistencia.