Caracterización molecular de aislados de Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis. Mapa epidemiológico en España
Elena Castellanos Rizaldos defendió su tesis doctoral en la Facultad de Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid
9 de julio de 2010
La paratuberculosis o enfermedad de Johne es una enfermedad crónica granulomatosa que afecta principalmente al aparato digestivo de rumiantes domésticos, aunque la infección puede presentarse además en otras especies. El agente etiológico está incluido dentro del complejo Mycobacterium avium y se denomina M. a. paratuberculosis.
El objetivo del trabajo presentado en esta tesis se basa en el desarrollo y aplicación de nuevas herramientas de caracterización molecular rápidas aplicadas a M. a. paratuberculosis; focalizadas en la descripción y el empleo de estas nuevas metodologías para caracterizar los aislados de crecimiento más lento (tipos I y III). Todos estos estudios se enmarcaron dentro de dos proyectos, AGL2005-07792 (Ministerio de Ciencia e Innovación de España) y ParaTBTools FP6-2004-FOOD-3B-023106 (Unión Europea).
Mediante las técnicas moleculares tradicionales, actualmente empleadas, como PFGE e IS900-RFLP las cepas de M. a. paratuberculosis se dividen en tres tipos; tipo I (también denominado “ovino”), II (“bovino”) y III (“intermedio”). Sin embargo, cabe destacar que la caracterización molecular de algunos aislados y en especial los de crecimiento más lento (tipos I y III) mediante estas técnicas no puede ser realizada debido a los requerimientos de ADN necesarios para llevarlas a cabo (tanto en calidad como en cantidad). Además, estas técnicas destacan por su complejidad y por lo tanto son difíciles de aplicar de manera rutinaria en la caracterización molecular de M. a. paratuberculosis.
La necesidad del desarrollo de nuevas técnicas moleculares rápidas, menos laboriosas y costosas capaces de discriminar entre los tres tipos de cepas de M. a. paratuberculosis nos dirigió a esta línea de trabajo. Por este motivo comenzamos con el diseño de técnicas de PCRs para amplificar genes de expresión constitutiva (house-keeping genes) que posteriormente se secuenciaron para hallar diferencias específicas únicas para cada uno de los tres grupos de cepas. De éstos, los genes gyrA y gyrB, topoisomerasas implicadas en la regulación de la estructura helicoidal del ADN, presentaron SNPs específicos de cada tipo (I, II y III). Al mismo tiempo, uno de los SNPs del gen gyrB en las cepas del tipo III presentaba una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Hpy188III. La restricción enzimática de las cepas de tipo III (genéticamente y fenotípicamente hasta la fecha únicamente diferenciables de las del tipo I mediante PFGE e IS900-RFLP) eran distinguibles respecto a las del tipo I y II.
Siguiendo con esta línea, el gen inh-A, cuyo producto de expresión es la enzima proteína reductasa transportadora de enoil-acil, involucrada en la elongación de ácidos grasos a ácidos micólicos también presentó SNPs específicos para cada uno de los tres tipos de cepas de M. a. paratuberculosis. Al igual que en el caso del gen gyrB, uno de los SNPs presentes en la secuencia del gen inh-A de las cepas del tipo III constituía una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción SinI, con perfiles de restricción diferentes en las cepas del tipo III con respecto a las del tipo I.
Más adelante, desarrollamos otra técnica basada en PCR y secuenciación de una de las regiones diana más empleadas en el diagnóstico y la identificación de M. a. paratuberculosis, la secuencia de inserción IS900. El análisis de las diferentes secuencias obtenidas de la IS900 también reveló SNP específicos para cada uno de los tipos de M. a. paratuberculosis (I, II y III). Estos hallazgos constituyen una herramienta más para la identificación de los tres tipos de cepas de M. a. paratuberculosis a partir de tan sólo una pequeña cantidad de ADN, como el obtenido a partir de muestras biológicas (sangre, tejidos, etc.).
Sin embargo, a pesar de la clara división en tres tipos de las cepas de M. a. paratuberculosis obtenida mediante diferentes técnicas moleculares, la dificultad de aislamiento de los fenotipos de crecimiento más lento y la limitada distribución geográfica de algunos de los tipos (especialmente de las cepas tipo III o intermedias) hacía que hasta la fecha muchos estudios únicamente se refirieran a las cepas de M. a. paratuberculosis como tipos “bovino” y “ovino”, obviando la existencia de un tipo “intermedio”. Por todo esto, en colaboración con la Universidad de Saint Georges (Londres, Reino Unido) realizamos una hibridación genómica comparada empleando la técnica de microarray en una colección de aislados de origen español y representantes de los tres tipos de M. a. paratuberculosis (I, II y III). Este trabajo puso de manifiesto las diferencias genéticas entre los tres tipos de cepas, observándose en todas las cepas de M. a. paratuberculosis del tipo I y III 62 ORFs homólogos al genoma de M. a. hominissuis 104 pero divergentes con respecto al genoma de M. a. paratuberculosis K-10. Además, al comparar las cepas tipo I y III con la cepa M. a. paratuberculosis K-10, las cepas tipo I analizadas presentaron deleciones en dos ORFs y las cepas tipo III en siete ORFs (de los cuales seis eran loci consecutivos). Empleando los datos anteriores se pusieron a punto técnicas de PCR dirigidas a fragmentos del genoma específicos para los tipos I y III, constituyendo nuevas herramientas para la identificación de éstos. No obstante, la técnica de microarray, técnica de la era post-genómica requiere personal cualificado para su realización, es un procedimiento costoso y sólo se puede llevar a cabo en las instalaciones adecuadas.
Debido a este hecho, y dada la gran cantidad de laboratorios que emplean la tecnología de PCR en tiempo real, pusimos a punto en colaboración con la Universidad de Calgary (Canadá) una técnica basada en los principios de tiempo real y de las diferencias en las curvas de disociación para caracterizar en tan sólo 1 hora y 30 minutos los aislados de M. a. paratuberculosis. Como complemento a este trabajo también empleamos los principios de esta técnica no sólo para diferenciar los subtipos de M. a. paratuberculosis, sino otros miembros de MAC con importancia tanto ambiental como clínica en el caso de pacientes inmunodeprimidos.
La necesidad de trazar los diferentes brotes de paratuberculosis que actualmente aparecen en las diferentes regiones geográficas, hacía imprescindible el desarrollo de una técnica capaz de subtipificar dentro las cepas de un mismo tipo. Por este motivo, y como complemento a los trabajos anteriores realizamos un análisis detallado de diferentes loci MIRU-VNTR en una selección de cepas. Como resultado de este trabajo describimos un nuevo locus (VNTR-259) y propusimos la estandarización del número de copias respecto a la interpretación de los resultados a partir de un gel de agarosa, al igual que se había hecho con anterioridad en otros miembros del género Mycobacterium. La combinación de loci empleada en el estudio (MIRU-2, MIRU-3, VNTR-25, VNTR-32 y VNTR-259) dio lugar a un valor de índice de discriminación HGDI de 0,84, un índice elevado e indicativo de la utilidad de esta técnica en lo que respecta a la trazabilidad epidemiológica de los brotes de la enfermedad. Además, dado que esta técnica de MIRU-VNTR no había sido empleada hasta la fecha en España para la subtipificación de otros miembros del complejo MAC, la aplicamos a su vez a cepas de M. a. avium aisladas de aves rapaces en libertad.
Finalmente, la puesta a punto de todas estas metodologías derivó en la identificación y caracterización molecular de una variedad de cepas del tipo II de M. a. paratuberculosis obtenidas de cabras de la raza Guadarrama no antes descritas. Estas cepas presentaban una deleción de 16 Kb en operones directamente relacionados con la virulencia de este microorganismo (entre ellos uno de los operones de entrada a células mamíferas, mce), por lo que representan la primera cepa mutante natural mce de M. a. paratuberculosis. La importancia de esta deleción en la que se comprendían diferentes genes de virulencia (genes mce y otros genes de la familia PE, Prolina-Ácido Glutámico y PPE, Prolina- Prolina-Ácido glutámico) se determinó mediante ensayos de supervivencia previa infección in vitro en cuatro líneas celulares (MOCL-4, BOMAC, THP-1 y CACO-2) y posterior amplificación del gen pre-ARNr 16S mediante PCR cuantitativa. A continuación, la importancia y regulación diferencial de los genes comprendidos dentro de la deleción de 16 Kb durante los procesos de invasión celular fueron evaluados a través del análisis transcriptómico de la cepa de referencia de M. a. paratuberculosis K-10 tras infección in vitro en las líneas celulares THP-1 y MOCL-4.
En resumen, la aplicación de todas las técnicas descritas a lo largo de la tesis varía en función de la finalidad así como de los medios de los que esté dotado el laboratorio en el que se vayan a aplicar. Así, en laboratorios que cuenten con la tecnología de PCR a tiempo real y análisis de las curvas de disociación de alta resolución, la aplicación de las técnicas descritas en el capítulo IV para la diferenciación de los tres tipos de cepas de M. a. paratuberculosis o de los diferentes miembros de MAC sería ideal por la rapidez de los resultados y la fácil reproducibilidad de los mismos.
Sin embargo, en aquellos laboratorios que no cuenten con esta tecnología, para la diferenciación de los tres tipos de cepas de M. a. paratuberculosis bastaría con la aplicación de una PCR dirigida a las regiones específicas de las cepas del tipo I y III (MAV4125: 306 pb o MAV4126: 303 pb) y de las del tipo III (MAP3584: 633 pb o MAP1435: 265 pb) descritas a nivel genómico mediante el análisis por microarray. Idealmente, la aplicación de una PCR múltiple dirigida a los genes MAV4125 o MAV4126 y MAP3584 diferenciaría los tres tipos de cepas, ya que las cepas del tipo I amplificarían ambos genes, las del tipo II solamente el gen MAP3584 y las del tipo III únicamente los genes MAV4125 o MAV4126.
Finalmente, y en el caso de que se trate de la recomendación de una técnica con fines epidemiológicos para realizar una trazabilidad entre brotes de paratuberculosis en un determinado país o explotación, la aplicación de la técnica de MIRU-VNTR sería recomendable por presentar un alto índice de discriminación a partir de aislados de elevada homogeneidad genética
