Tesis Doctoral defendida por Mª Victoria Ortega García en el Centro VISAVET de la Universidad Complutense de Madrid

27 de julio de 2021

La leishmaniosis es un conjunto de enfermedades parasitarias de origen zoonósico y antroponósico causadas por protozoos del género Leishmania, de la familia Trypanosomatidae. La transmisión al hospedador vertebrado se produce mediante la picadura de las hembras del flebótomo, insectos hematófagos pertenecientes a los géneros Phlebotomus (Viejo Mundo) o Lutzomyia (Nuevo Mundo), de la familia Psychodidae. Dentro de las parasitosis, la leishmaniosis ocupa el segundo lugar como causa más frecuente de muerte en el mundo por detrás de la malaria.

Además, esta enfermedad se encuadra dentro del grupo de enfermedades tropicales desatendidas (ETD), siendo prevalente en más de 98 países, con unos 350 millones de personas en riesgo y unos 12 millones de casos.

El reservorio principal de la leishmaniosis en el área mediterránea es el perro y el agente etiológico Leishmania infantum. En la última década se ha demostrado que conejos y liebres silvestres pueden actuar como hospedadores, evidenciándose así un cambio en la epidemiología de esta enfermedad. El mayor brote de leishmaniosis humana notificado en Europa comenzó en el 2009 en la Comunidad de Madrid (España). Desde entonces, se han declarado más de 700 casos y por primera vez se demostró que los lepóridos silvestres son reservorios competentes del parásito. Este brote tuvo una etiología multifactorial atribuible, en parte, a las modificaciones urbanísticas desarrolladas los últimos años en las áreas afectadas.

Concurrieron en esta área una mayor densidad de vectores y un aumento de las poblaciones de lepóridos. Aumento, probablemente debido a la falta de depredadores, entre otras causas. Atendiendo a estos antecedentes y teniendo en cuenta la relevancia que, por derecho propio, se le está dando al control epidemiológico en animales que en el momento actual escapan a dicho control, con el presente estudio se ha pretendido contribuir a un modelo que permita una mejor vigilancia para la prevención de nuevos brotes. Para ello, se llevó a cabo la detección de Leishmania spp. en reservorios atípicos y la caracterización molecular de aislados de L. infantum procedentes de dichos reservorios. Los trabajos realizados se describen en esta tesis doctoral, presentados en cuatro estudios experimentales, agrupados en tres capítulos.

En el primer estudio experimental, llevado a cabo en muestras de pelo, piel y bazo de conejos europeos (Oryctolagus cuniculus) y liebres ibéricas (Lepus granatensis), se detectó la presencia del parásito mediante una PCR en tiempo real (qPCR), previamente validada para la detección de L. infantum en perros, y mediante una PCR anidada. Los resultados obtenidos por ambos métodos de diagnóstico etiológico se compararon con los obtenidos mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) y aislamiento del parásito en cultivo in vitro. La qPCR resultó ser más sensible que la PCR anidada en todas las muestras analizadas, con un límite de detección para el ADN genómico de L. infantum de 143 fg/reacción (3,9 parásitos). Además, el porcentaje de animales positivos detectados por qPCR, fue de al menos 1,4 veces superior a los detectados por IFI y por esta técnica 6,7 veces mayor que por aislamiento. Si se considera el aislamiento y cultivo in vitro como método de referencia para nuestro primer estudio, la mayor concordancia con éste se obtuvo mediante PCR anidada en muestras de bazo/piel y con qPCR en muestras de bazo. Teniendo en cuenta que, por un lado, la PCR anidada es menos sensible y por lo tanto más cercana a lo obtenido por aislamiento y cultivo donde los casos de infección están claramente infravalorados, y por otro, que solo los animales positivos a la qPCR en muestras de bazo se considerarían verdaderamente infectados. Estos resultados demuestran que la qPCR es un método adecuado para detectar material genómico de Leishmania en muestras de distinta naturaleza, además de confirmar al pelo como una matriz óptima para el diagnóstico directo, fiable y no invasivo de leishmaniosis en animales silvestres.

En el segundo estudio experimental se describió la patología de la infección natural por L. infantum en lagomorfos. Los resultados obtenidos en el estudio anatomopatológico mediante inmunofluorescencia directa (IFD) se compararon con los del diagnóstico serológico (IFI) y el diagnóstico etiológico mediante qPCR. En el análisis histológico solo se observaron pequeñas lesiones compatibles con una leishmaniosis subclínica, sin otros signos inflamatorios. Se confirmó mediante IFD la presencia de amastigotes en todos los tipos de tejidos analizados: bazo, ganglio linfático, médula ósea, tracto gastrointestinal, hígado, páncreas, músculo estriado cardiaco, músculo estriado esquelético, pulmón, riñón, meninges y en la piel, lo que dio una idea del grado de diseminación del parásito durante la infección. En el 21 % de los conejos y 100 % de las liebres previamente diagnosticados como positivos mediante IFD, se confirmó la presencia de L. infantum mediante qPCR sobre muestras de bazo y/o piel. Así, en este trabajo se ratificó que la IFD es útil para diagnosticar leishmaniosis, ayudando además a la localización precisa del parásito en los distintos tejidos, sirviendo de guía a las pruebas de detección molecular como la qPCR.

En el tercer estudio experimental se describieron cuatro casos de leishmaniosis cutánea equina en Costa Rica, afección poco descrita en el momento en el que se realizó el trabajo. El estudio anatomopatológico englobó la identificación del parásito por inmunohistoquímica (IHQ), utilizando un anticuerpo policlonal de conejo producido frente Leishmania spp. En las lesiones, junto con los amastigotes, se apreció una reacción inflamatoria granulomatosa en la dermis con macrófagos multinucleados, células gigantes, linfocitos y pocos neutrófilos y eosinófilos. Los resultados obtenidos enfatizan la importancia de Leishmania spp., no solo como agente causal de la leishmaniosis cutánea equina, sino también la necesidad de incluir estos mamíferos en el control epidemiológico de la enfermedad. La leishmaniosis es uno de los problemas parasitarios de salud pública prevalentes en todo el mundo y los équidos, por ser animales domésticos, pueden desarrollar un papel muy importante en la epidemiología de la enfermedad.

Por último, en el cuarto estudio experimental, se llevó a cabo la caracterización de los fragmentos de restricción mediante la combinación de la reacción en cadena de la polimerasa y los polimorfismos de longitud de los mismos (PCR-RFLP), en parásitos procedentes de liebres y conejos silvestres tanto de dentro como fuera del área del brote, analizados paralelamente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y electroforesis capilar. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que no existen diferencias entre los parásitos de distinta procedencia ni siquiera con los promastigotes provenientes de cultivo axénico del aislado de L. infantum (MCAN/ES/97/10 445, zimodema ZM/MON-1) utilizado de referencia. Por lo tanto, quedaba demostrado que, mediante la técnica aplicada, hay un único aislado de L. infantum responsable de la infección en los lagomorfos silvestres y que sustentan el ciclo silvestre de la enfermedad, tanto en el área del brote como fuera de la mismo.

Como conclusión general se puede decir que para la vigilancia epidemiológica de la leishmaniosis en reservorios atípicos (domésticos y silvestres), con el objeto de prevenir la aparición de futuros brotes, la qPCR en muestras de pelo es una técnica fiable, rápida, sensible, específica y no invasiva que puede complementarse con otras como la IFD o la IHQ cuando se llevan a cabo estudios anatomopatológicos.

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