Evaluación de nuevas vacunas frente a la tuberculosis en ganado caprino y avances en su diagnóstico inmunológico

Tesis Doctoral defendida por Álvaro Roy Cordero en el Centro VISAVET de la Universidad Complutense de Madrid

11 de diciembre de 2020

La tuberculosis en ganado caprino es una micobacteriosis zoonósica, principalmente causada por M. caprae y M. bovis, que produce importantes pérdidas económicas en el sector caprino y supone un reservorio de la enfermedad para otras especies domésticas y silvestres. El diagnóstico activo de la enfermedad en ganado caprino solo se realiza en aquellos países que tienen implantados programas de erradicación de tuberculosis en ganado bovino, en concreto, en aquellas explotaciones de ganado caprino que conviven o tienen algún nexo con ganado bovino infectado. En España, sin embargo, se han implantado programas de erradicación específicos en ganado caprino en algunas Comunidades Autónomas con censos importantes. Estos programas se basan principalmente en el uso de la intradermotuberculinización (IDTB), y puntualmente en el uso de la prueba de detección de IFN-γ (IGRA) en explotaciones infectadas. Además, existen algunas técnicas serológicas de detección de anticuerpos comercializadas y otras en fase experimental. El rendimiento de estas técnicas de diagnóstico se ha evaluado en algunos estudios puntuales en estos últimos 20 años, pero no existe hasta la fecha ninguna revisión sistemática ni metaanálisis sobre la precisión de estas técnicas en ganado caprino. Este fue el objetivo del primer estudio de esta tesis doctoral, en el cual se realizó una revisión sistemática de las técnicas de diagnóstico ante mortem de tuberculosis, no solo limitada a ganado caprino, sino abarcando también al ganado ovino. La mayoría de estudios revisados se llevaron a cabo en España (41%), en cabras (76%), y la IDTB fue la técnica más empleada (89%). La mayoría de los estudios describieron procedimientos y puntos de corte iguales o similares a los empleados en el ganado bovino, aunque esta circunstancia no evitó observar heterogeneidad entre los mismos. La información notificada en los distintos estudios revisados presentó algunas carencias en algunos campos que pueden ser determinantes en el rendimiento de la prueba (por ejemplo, en el caso de la IDTB, la potencia de la tuberculina, el fabricante o la zona de inoculación). En nuestro estudio, la sensibilidad estimada de la IDTB simple (51% y 59%, dependiendo del criterio de interpretación) y comparada (30% y 50%, dependiendo del criterio de interpretación) fue inferior a la descrita en la bibliografía en el ganado bovino, aunque la especificidad fue elevada en ambos casos (igual o superior a 95%). Sin embargo, la especificidad estimada de la IDTB simple se vio comprometida en ensayos que notificaron la vacunación frente a M. avium subsp. paratuberculosis (MAP) (78% y 90% dependiendo del criterio de interpretación). Por otra parte, la sensibilidad del IGRA fue ligeramente superior a la IDTB (66% y 72%, dependiendo del punto de corte), manteniendo una buena especificidad (entre 98% y 99%). Desgraciadamente, la elevada heterogeneidad hallada entre estudios en el cálculo de la mayoría de las estimaciones agrupadas de sensibilidad y especificidad de las técnicas impidió obtener unos resultados concluyentes. No obstante, nuestros resultados preliminares indicarían la recomendación de emplear varias pruebas en paralelo en explotaciones infectadas para aumentar la sensibilidad diagnóstica. También ponen de manifiesto la necesidad de más estudios de optimización de las técnicas diagnósticas en ganado caprino, con especial interés en la evaluación de las técnicas serológicas por su potencialmente buena relación de coste-efectividad.

El segundo estudio de la presente tesis se realizó con objeto de evaluar la interferencia observada por la vacunación frente a MAP en las técnicas diagnósticas de tuberculosis empleadas en ganado caprino, principalmente en la IDTB simple. Concretamente, la finalidad del estudio fue evaluar la tendencia temporal de la interferencia causada por la vacunación frente a MAP en la IDTB, IGRA y dos técnicas serológicas de detección de anticuerpos (ELISA P22 y DR-ELISA). En este sentido, en una cohorte de 99 cabras vacunadas con Gudair a los siete meses de edad de una explotación sin antecedentes previos de tuberculosis, la vacunación produjo un porcentaje variable y decreciente de reactores en la IDTB simple hasta los 12 meses tras la vacunación, momento en el que no se observaron reactores positivos. La IDTB comparada y el IGRA demostraron ser técnicas muy específicas independientemente del tiempo posvacunación, y la especificidad de las técnicas serológicas disminuyó progresivamente por la realización de repetidas IDTB en intervalos de tres meses tras la vacunación.

En el último estudio de este primer capítulo de diagnóstico se evaluó la utilidad de las muestras de leche para la detección de anticuerpos frente a tuberculosis empleando un ELISA experimental (ELISA P22). Para ello, se recogieron muestras de suero y leche de dos explotaciones de ganado caprino con distinta prevalencia, una de alta prevalencia aparente (72,2%) y otra de baja prevalencia aparente (7,3%) a las pruebas de base celular (IDTB e IGRA). Las muestras de leche recogidas para el estudio procedieron de los animales en lactación de cada explotación. La correlación entre los títulos de anticuerpos de muestras de leche y suero fue muy fuerte en la explotación de alta prevalencia (rs = 0,91) y moderada en la de baja prevalencia (rs = 0,46). En lo relativo a los resultados preliminares del rendimiento diagnóstico en un grupo de animales sacrificados de manera aleatoria al final del estudio, el ELISA P22 usando muestras de suero o leche fue la técnica diagnóstica que detectó el porcentaje más alto de animales que presentaron lesiones compatibles y/o cultivo positivo. En este estudio también se pudo concluir que la conservación de las muestras de leche refrigeradas en azidiol durante una semana no afectó al resultado cualitativo ni cuantitativo de la prueba. Estos resultados preliminares indican que el uso en paralelo de la IDTB y el ELISA P22 en explotaciones infectadas, ya sea empleando muestras de suero o leche, puede suponer una herramienta diagnóstica eficiente y económicamente viable para maximizar la detección de animales infectados y acelerar el control de los brotes. Por otra parte, aunque todavía son necesarios más estudios en distintas explotaciones con diferente prevalencia y número de animales en lactación, las muestras de tanque de leche podrían suponer una opción de cribado a nivel de explotación en regiones donde no se aplican programas de erradicación o no es viable la realización de un diagnóstico individual.

El segundo capítulo de esta tesis comprende cuatro estudios relativos a la evaluación de nuevas vacunas frente a la tuberculosis y el efecto preventivo o terapéutico de la suplementación con vitamina D en ganado caprino expuesto a una infección natural. En los dos primeros trabajos de investigación se estudió la inmunogenicidad y eficacia de la vacuna M. bovis inactivada por calor HIMB en ganado caprino. En el primer estudio, HIMB se administró por vía intramuscular y oral empleando un protocolo de vacunación-revacunación. El grupo vacunado por vía oral no presentó ningún reactor positivo en la IDTB, en el IGRA ni en un ELISA experimental basado en PPD bovina a los dos meses de la administración de la segunda dosis. Sin embargo, se observó interferencia en la mayoría de los animales del grupo vacunado por vía intramuscular en la IDTB simple y en el IGRA (68,8% y 62,5%, respectivamente). La eficacia de esta vía de administración se evaluó en el quinto estudio de esta tesis, en el que la vacunación con HIMB por vía intramuscular confirió una protección parcial frente a una infección natural de M. caprae, concretamente reduciendo el número de lóbulos pulmonares craneales con lesiones en los animales vacunados con respecto al grupo control tras una exposición natural de diez meses de duración. Sin embargo, la reducción global en términos de gravedad de las lesiones no fue significativa.

Los dos últimos estudios de este capítulo de vacunación incluyen la evaluación de la eficacia de las vacunas BCG y MTBVAC y de la suplementación con vitamina D en ganado caprino empleando el mismo sistema de infección natural del quinto estudio. Los resultados de estos dos estudios tienen aplicación en dos vertientes, la primera es la utilidad directa de MTBVAC y la suplementación con vitamina D en ganado caprino u otros hospedadores animales relacionados, y la segunda está enfocada a aportar nuevos datos preclínicos empleando un modelo experimental cabra frente a una infección natural de M. caprae. MTBVAC es una vacuna M. tuberculosis atenuada mediante la deleción de los genes genes phoP y fadD26 que se postula como candidata para sustituir a la BCG en neonatos o como refuerzo de esta en adolescentes, y que actualmente se encuentra en fase clínica. En este sentido, el sexto estudio consistió en la evaluación de la inmunogenicidad y eficacia de las vacunas BCG y MTBVAC. Para la consecución de tales objetivos se empleó un modelo de transmisión natural en el que los dos grupos vacunales y otro control fueron expuestos a un grupo de animales infectados con M. caprae durante nueve meses. En lo que respecta a los resultados de inmunogenicidad, MTBVAC presentó una mayor respuesta de IFN-γ tras la estimulación con PPD bovina en el IGRA y un mayor número de animales positivos en comparación con el grupo BCG al mes posvacunación, si bien también se observó cierta reactividad cuando se emplearon los antígenos ESAT-6 y CFP-10. Esta aparentemente mayor inmunogenicidad en el IGRA no se correlacionó con protección y pone de manifiesto la necesidad de buscar nuevos antígenos DIVA (differentiating infected from vaccinated animals) específicos para distinguir infectados de vacunados con MTBVAC. En lo relativo al grado y extensión de las lesiones post mortem observadas, estos parámetros fueron menores en los linfonodos pulmonares y en el total de los órganos examinados en los grupos MTBVAC y BCG, en los pulmones en el grupo BCG y en el número de animales con lesiones extrapulmonares en el grupo MTBVAC con respecto al grupo control, no encontrándose diferencias entre ambos grupos vacunales.

Por último, algunos estudios han incluido la suplementación con vitamina D, dentro de las llamadas terapias dirigidas al hospedador en humanos (host-directed therapies o HTDs), como terapia complementaria al tratamiento antibiótico para mejorar el resultado clínico o acortar el tratamiento por un lado, y por otro lado, como estrategia preventiva para potenciar el sistema inmune y prevenir el desarrollo de la enfermedad. No obstante, apenas hay estudios del efecto inmunomodulador de la vitamina D en animales domésticos y únicamente un estudio previo en ciervos y jabalíes ha evaluado el efecto que tiene la suplementación con vitamina D en la prevención y el desarrollo de lesiones de tuberculosis. En el último estudio de esta tesis se evaluó el efecto profiláctico y/o terapéutico de la suplementación con vitamina D en ganado caprino expuesto a una infección natural de M. caprae durante diez meses. En este estudio, la suplementación con vitamina D3 no tuvo ningún efecto en la supresión de la respuesta de tipo Th1 en términos de niveles de IFN-γ detectados en el IGRA tras la estimulación con PPD bovina, detectándose incluso reactores al IGRA y la IDTB con anterioridad en el grupo suplementado. En lo que respecta a la eficacia, nuestros resultados indicaron que la suplementación con dosis elevadas de vitamina D3 cada dos meses no redujo ni el riesgo de infección ni el número de animales con lesiones o aislamientos de M. caprae, ni la gravedad ni en el número de lesiones observadas por animal. Por el contrario, el grupo suplementado presentó hiperfosfatemia y daño renal con calcificaciones asociadas a una intoxicación con vitamina D.