Tesis Doctoral defendida por Pedro Miguela Villoldo en el Centro VISAVET de la Universidad Complutense de Madrid

2 de octubre de 2023

La colistina es un polipéptido catiónico en desuso como antibiótico desde la década de los setenta debido a su toxicidad, pero que fue reintroducido en medicina humana para tratar infecciones causadas por bacterias Gram negativas multirresistentes, siendo categorizado como antimicrobiano de “último recurso”. En medicina veterinaria la colistina se ha utilizado desde su descubrimiento para el tratamiento de infecciones en animales, especialmente las diarreas post-destete causada por E. coli en lechones y terneros o para el tratamiento de colibacilosis en aves.

Inicialmente, la resistencia a colistina parecía estar ligada exclusivamente a mutaciones en los genes de sistemas de doble componente pmrA/B y phoP/Q, localizados en el cromosoma bacteriano. Sin embargo, en 2015 se describió por primera vez un gen de resistencia a colistina que se denominó mcr-1 y que estaba localizado en un plásmido. Dado que la colistina era una de las pocas alternativas disponibles para el tratamiento de infecciones por bacterias Gram negativas multirresistentes y que la dispersión de este gen plasmídico podría aumentar exponencialmente debido a fenómenos de transferencia horizontal, la Agencia Europea del Medicamento (European Medicines Agency, EMA) recomendó en 2016 reducir el uso de colistina en animales.

La presente tesis doctoral, titulada “Identificación y caracterización de bacterias resistentes a colistina procedentes de diversos entornos de España. Evaluación de su persistencia y posible diseminación”, se ha centrado en el estudio de enterobacterias resistentes a colistina desde diferentes enfoques fenotípicos y moleculares.

En la tesis se ha llevado a cabo el aislamiento y la caracterización fenotípica de bacterias resistentes a colistina y la detección molecular de los genes de la familia mcr asociados a la esta resistencia. A partir de aislados procedentes de animales, de alimentos de origen animal y agua recogida en una planta de tratamiento de efluentes urbanos, se aislaron enterobacterias resistentes a colistina, cuyo análisis fenotípico reveló niveles de resistencia moderados, situándose los valores de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) entre 4 y 8 mg/L. La mayoría de los aislados mostraron resistencia, además, a otros antimicrobianos. La detección de genes mcr evidenció una frecuencia del gen mcr-1 significativamente mayor que el resto de integrantes de la familia mcr. Aunque en menor proporción, se detectó también el gen mcr-4 y, de forma ocasional, los genes mcr-2 y mcr-3. Los genes mcr mostraron una distribución diferente según la especie bacteriana en la que se encontraban. La mayoría de aislados de E. coli albergaron genes mcr, siendo la variedad mcr-1 la más frecuente. Las variantes mcr-2 y mcr-3 fueron detectadas únicamente en esta especie. Sin embargo, la presencia de genes mcr no resultó ser tan común en bacterias como Salmonella enterica o Klebsiella pneumoniae que, aun siendo fenotípicamente resistentes a colistina, presentaron mcr en menos de la mitad de los aislados; o las especies del género Enterobacter, en la que ningún aislado mostró presencia de genes mcr.

Mediante técnicas de secuenciación masiva se llevó a cabo el estudio del entorno genético de los genes mcr. Este estudio reveló que la mayoría de genes mcr-1 se encontraban en plásmidos conjugativos de tipo IncX4 e IncHI2, apareciendo en todos estos casos con el gen pap2 en su entorno genético, mientras que los genes mcr-4 solo se localizaron en plásmidos pequeños no conjugativos de tipo ColE10. Atendiendo a la línea temporal se pudo observar que entre 2006 y 2017 los genes mcr se encontraban mayoritariamente localizados en plásmidos conjugativos de pequeño tamaño (IncX4), mientras que los plásmidos portadores de mcr de mayor tamaño (IncHI2) comenzaron a aumentar su frecuencia a partir de 2010, alcanzando valores similares a IncX4 en 2018. Sin embargo, a partir de este año se observó otro cambio de tendencia caracterizado por el aumento del número de aislados que presentaban los genes mcr en el cromosoma bacteriano, alcanzando valores superiores a los localizados en plásmidos.

También se analizó el efecto que la congelación de muestras biológicas ejerce sobre la población de enterobacterias resistentes a colistina y sobre el gen mcr-1 y las técnicas empleadas para su estudio, cultivo bacteriano en un caso y detección molecular por qPCR en el otro. La congelación de muestras de contenido cecal durante seis meses a -40 oC produjo una reducción del 84% en la viabilidad y diversidad de enterobacterias resistentes a colistina, mientras que los resultados de qPCR no se vieron alterados. Estos datos sugieren que las técnicas basadas en la detección del ADN son la mejor opción para para el estudio retrospectivo de la resistencia a colistina en muestras almacenadas en congelación, pudiendo ser complementadas con métodos basados en cultivo tradicional.

Con el propósito de estudiar la evolución del gen mcr-1 a lo largo del tiempo se llevó a cabo su cuantificación por PCR cuantitativa directamente sobre las muestras de contenido cecal. Los resultados obtenidos evidenciaron una progresión ascendente de los niveles de mcr-1 desde 2004 hasta 2015, año a partir del cual la cantidad del gen comenzó a descender hasta obtener en 2021 valores de cuantificación del gen similares a los observados en 2008. Este descenso coincidente con la limitación en el uso de colistina en animales, recomendada por la EMA y la Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios (AEMPS), evidenció la relación existente entre ventas de polimixinas y resistencia a colistina asociada al gen mcr-1.

Por último, se evaluó la estabilidad y diseminación de cepas resistentes a colistina portadoras del gen mcr-1 en un estudio in vivo, empleando Salmonella enterica como especie portadora del gen y pollos como modelo animal, para determinar el efecto que la administración de este antimicrobiano pudiera tener en la selección de cepas resistentes. De los cuatro grupos en que se dividió a los animales, en dos de ellos (G3 y G4) se puso en contacto a los pollos con la cepa bacteriana y dos quedaron libres. Asimismo, dos grupos fueron tratados con colistina durante siete días (G2 y G4), manteniendo por tanto un grupo libre tanto de tratamiento como de exposición a la bacteria portadora del gen (G1). Los resultados evidenciaron una mayor cuantificación de mcr-1 en los grupos de animales inoculados con dicha bacteria, alcanzando antes (día 14) los niveles máximos en el grupo tratado con colistina (G4) con respecto al grupo no tratado (G3). Además, ambos grupos igualaron sus niveles de mcr-1 en el día 21 de estudio y, sin embargo, redujeron los de Salmonella spp., indicando que el mantenimiento de los niveles de mcr-1 podría deberse a fenómenos de transferencia horizontal entre bacterias intestinales.