Comunicación oral en XXVI Edición del Simposio Nacional AVEDILA

20 de noviembre de 2023

Lorente-Leal V., Sanchez-Martin L., Alende T., Lozano F., Saez-LLorente JL., Bezos J., de Juan L. y Romero B.

La Directiva 2016/429 (Ley de Sanidad Animal) autoriza a los Países Miembro de la Unión Europea (UE) el empleo de la detección de ácido nucleico mediante PCR a tiempo real (qPCR directa) para confirmar los casos sospechosos de la infección por los miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (CMTB), en el marco de los programas de erradicación de la tuberculosis bovina. Aunque la qPCR es una técnica con una mayor sensibilidad y rapidez que el cultivo microbiológico, comúnmente considerada la técnica de referencia, su rendimiento viene determinado en gran medida por el método de extracción empleado para aislar el material genético del CMTB en tejidos frescos. Tradicionalmente, las extracciones de ADN a partir de tejido se han realizado empleando columnas de sílice. Sin embargo, estos métodos son difícilmente escalables y su éxito radica en el pH de los tampones y el mantenimiento de la
integridad de las columnas empleadas durante el proceso. En los últimos años ha aumentado el interés por los protocolos de extracción basados en cuentas magnéticas como una alternativa fácilmente automatizable y con una mayor capacidad de muestras.
El objetivo de este estudio fue evaluar el rendimiento del kit MagMAX CORE Nucleic Acid
Purification Kit y el sistema KingFisherTM Flex de ThermoFisher Scientific (MgMx-KF) para la extracción de ADN del CMTB en muestras de animales. Para ello, se seleccionaron 96 muestras de tejido procedentes de ganado bovino (n = 75) y caprino (n = 21) que habían dado positivo (n = 47) o negativo (n = 49) al aislamiento de miembros del CMTB por cultivo microbiológico. Se procedió a la extracción del ADN a partir de los homogeneizados de tejido empleando el protocolo MgMx-KF y se detectó el ADN del CMTB empleando el kit de qPCR VetMAXTM M. tuberculosis Complex (ThermoFisher) (VM-TF) y una qPCR basada en la detección de la IS6110 y el kit
QuantiFast Pathogen + IC (Qiagen) (qPCR EU-RL) [1]. Los resultados se compararon con aquellos obtenidos empleando sendas qPCRs con ADN extraído mediante el kit basado en columnas DNEasy Blood & Tissue (Qiagen).
Se detectó ADN del CMTB mediante ambos protocolos de extracción en 46 muestras cultivo positivas, y ninguna de las muestras negativas al cultivo dio positivo a ambas qPCRs, obteniéndose así una sensibilidad y especificidad diagnóstica del 97,87% [95% IC: 88,71-99,95%] y 100,00% [92,75-100,00%], respectivamente. La concordancia entre qPCRs fue elevada [κ = 0,96; 95% IC: 0,90-1,00], detectándose tan sólo una discordancia entre qPCRs y entre métodos de extracción. Se detectó un mayor número (10,4%; n = 10) de inhibiciones al emplear la qPCR EU-RL en las extracciones MgMx-KF, todas ellas en muestras negativas.
Los resultados de esta evaluación reflejan un elevado rendimiento del kit MgMx-KF para la extracción de ADN del CMTB, así como de las qPCRs analizadas para detectarlo. Esto sugiere que el kit MgMx-KF puede ser una buena alternativa para escalar y automatizar los procesos de extracción de ADN en tejidos animales. La detección de un mayor número de inhibiciones en la qPCR EU-RL podría estar relacionada con una mayor concentración de ADN del hospedador, debido al mayor volumen de muestra procesado. Esto podría sugerir la necesidad de adaptar este protocolo a la hora de analizar extractos obtenidos mediante el MgMx-KF

	Servicio de Micobacterias (MYC). Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET). Universidad Complutense (UCM).
	Subdirección General de Sanidad e Higiene Animal y Trazabilidad. Dirección General de la Producción Agraria. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA).
	Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense (UCM).

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